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目的:TCTN1(Tectonic family member1)蛋白属于tectonic家族成员之一,最近几年,文献报道指出TCTN1与肿瘤存在紧密联系,目前TCTN1与CRC的关系如何尚未见报道。本研究尝试研究TCTN1在CRC中的功能及意义。
方法:1.我们收集了华美医院肛肠外科2017年1月-2017年12月收治的72例CRC患者的肿瘤组织和配对的癌周健康组织,选用实时荧光PCR和免疫印迹试验检测72例CRC样本及癌周健康组织中TCTN1mRNA和蛋白的表达,使用统计学方法分析TCTN1在肠癌组织及癌旁组织中表达是否不同及比较CRC组织中TCTN1表达水平和CRC患者病理参数的相关性。
2.获取TCTN1高表达肠癌细胞株,应用CRISPR/Cas9技术敲低TCTN1,应用实时荧光定量PCR及WB检测肠癌细胞TCTN1表达是否下调。实验分组,TCTN1敲低肠癌细胞组记为TCTN1(-),野生型结肠癌细胞组记为TCTN1(+),正常结肠上皮组记为Con。继而观察敲低TCTN1是否影响肠癌细胞的生物学行为。
3.应用WB检测HCT116细胞TCTN1(-)组相比对照组凋亡蛋白的变化情况,观察敲低TCTN1是否影响肠癌细胞凋亡蛋白的表达。
结果:1.荧光定量PCR测定显示,TCTN1mRNA在CRC中表达量是0.54±0.06,在癌周健康组织中的表达量是0.26±0.08(p<0.05);WB检测结果显示,TCTN1蛋白于CRC中表达量为0.64±0.15,于癌周健康组织的表达量为0.34±0.13(P<0.01)。卡方检验分析TCTN1表达情况与CRC患者病理信息的相关性,结果示TCTN1表达与CRC患者TNM期别有关(p=0.005),而与其他参数没有显著相关性。
2.根据生长曲线分析,两种细胞TCTN1(-)组在第5天的OD595均低于对照组(p<0.001,p<0.001)。平板克隆实验示HCT116细胞TCTN1(-)组集落数明显少于对照组(2.33±1.53vs83.33±2.52,p<0.001)。流式细胞分析示,TCTN1(-)组处于G0/G1期的细胞数相比对照组减少(p<0.01),处于G2/M期的细胞数相比对照组增多(p<0.01),而在Sub-G1期的细胞数相比对照组明显上升(p<0.01)。根据凋亡散点图分析,TCTN1(-)组凋亡细胞数在前3个时期(凋亡早期、凋亡晚期、坏死细胞)均高于对照组,但是正常活细胞数较对照组减少(p<0.01)
3.通过WB实验分析凋亡蛋白的水平,发现HCT116细胞TCTN1(-)组凋亡蛋白Bcl-2,起始胱冬肽酶-3明显下调,而PARP和效应胱冬肽酶-3明显上调(p<0.001)。
结论:1.TCTN1在CRC组织相比癌旁组织呈高表达,且其表达量与CRC患者的TNM分期相关
2.抑制TCTN1的表达将抑制结肠癌细胞的增殖、干扰细胞周期进程、促使细胞凋亡。
3.下调TCTN1后肠癌细胞抑制Bcl-2合成而上调PARP、效应胱冬肽酶-3的表达水平从而促进细胞进入凋亡,最终使细胞走向死亡。
方法:1.我们收集了华美医院肛肠外科2017年1月-2017年12月收治的72例CRC患者的肿瘤组织和配对的癌周健康组织,选用实时荧光PCR和免疫印迹试验检测72例CRC样本及癌周健康组织中TCTN1mRNA和蛋白的表达,使用统计学方法分析TCTN1在肠癌组织及癌旁组织中表达是否不同及比较CRC组织中TCTN1表达水平和CRC患者病理参数的相关性。
2.获取TCTN1高表达肠癌细胞株,应用CRISPR/Cas9技术敲低TCTN1,应用实时荧光定量PCR及WB检测肠癌细胞TCTN1表达是否下调。实验分组,TCTN1敲低肠癌细胞组记为TCTN1(-),野生型结肠癌细胞组记为TCTN1(+),正常结肠上皮组记为Con。继而观察敲低TCTN1是否影响肠癌细胞的生物学行为。
3.应用WB检测HCT116细胞TCTN1(-)组相比对照组凋亡蛋白的变化情况,观察敲低TCTN1是否影响肠癌细胞凋亡蛋白的表达。
结果:1.荧光定量PCR测定显示,TCTN1mRNA在CRC中表达量是0.54±0.06,在癌周健康组织中的表达量是0.26±0.08(p<0.05);WB检测结果显示,TCTN1蛋白于CRC中表达量为0.64±0.15,于癌周健康组织的表达量为0.34±0.13(P<0.01)。卡方检验分析TCTN1表达情况与CRC患者病理信息的相关性,结果示TCTN1表达与CRC患者TNM期别有关(p=0.005),而与其他参数没有显著相关性。
2.根据生长曲线分析,两种细胞TCTN1(-)组在第5天的OD595均低于对照组(p<0.001,p<0.001)。平板克隆实验示HCT116细胞TCTN1(-)组集落数明显少于对照组(2.33±1.53vs83.33±2.52,p<0.001)。流式细胞分析示,TCTN1(-)组处于G0/G1期的细胞数相比对照组减少(p<0.01),处于G2/M期的细胞数相比对照组增多(p<0.01),而在Sub-G1期的细胞数相比对照组明显上升(p<0.01)。根据凋亡散点图分析,TCTN1(-)组凋亡细胞数在前3个时期(凋亡早期、凋亡晚期、坏死细胞)均高于对照组,但是正常活细胞数较对照组减少(p<0.01)
3.通过WB实验分析凋亡蛋白的水平,发现HCT116细胞TCTN1(-)组凋亡蛋白Bcl-2,起始胱冬肽酶-3明显下调,而PARP和效应胱冬肽酶-3明显上调(p<0.001)。
结论:1.TCTN1在CRC组织相比癌旁组织呈高表达,且其表达量与CRC患者的TNM分期相关
2.抑制TCTN1的表达将抑制结肠癌细胞的增殖、干扰细胞周期进程、促使细胞凋亡。
3.下调TCTN1后肠癌细胞抑制Bcl-2合成而上调PARP、效应胱冬肽酶-3的表达水平从而促进细胞进入凋亡,最终使细胞走向死亡。