论文部分内容阅读
饲料霉菌毒素污染影响肉鸡健康和生产,并对食品安全造成潜在威胁,降低饲料霉菌毒素对肉鸡的危害是生产中的重要技术需求。黄曲霉毒素B1（AFB1）是对肉鸡造成严重危害的一种霉菌毒素,具有肝细胞毒性、生殖和免疫毒性,其污染问题日益受到重视。目前,通过营养干预提高机体对AFB1的解毒能力并进行生物降解已成为潜在的有效策略。已有研究证实,硒能够提高肉鸡对AFB1的生物解毒作用,但不同硒形式的功效存在差异。相较于有机和无机形式,纳米硒因其尺寸效应和更高的生物利用率,营养功效也更为显著。然而,纳米硒在制备过程中不稳定、容易发生团聚。利用天然多糖聚合物作为模板制备纳米硒,能够增强纳米硒的稳定性,也可以使纳米硒在保留自身功效的同时兼具多糖的生物活性。但目前有关纳米硒-浒苔多糖（NPSe-EPS）的制备及其对AFB1诱导肉仔鸡肝脏损伤的研究尚未见报道。因此,本研究旨在制备稳定的NPSe-EPS,结合体外和体内试验,研究其对AFB1暴露肉仔鸡肝脏损伤的保护作用,并初步探索潜在的作用机制。1.NPSe-EPS的制备研究本试验以浒苔多糖为模板,利用抗坏血酸（Vc）还原亚硒酸钠的反应,制备粒径适宜的NPSe-EPS。采用正交设计结合单因素试验方法研究浒苔多糖浓度、反应温度和反应时间对制备出的纳米硒粒径大小、形貌和稳定性的影响。采用双波长比色法和扫描电子显微镜（SEM）对制得的纳米硒进行表征,采用能谱仪（EDS）对NPSe-EPS的元素种类及含量进行分析。结果表明,本研究中制备NPSe-EPS的最优条件为:浒苔多糖浓度400 mg/kg、反应温度60℃,反应时间1 h;SEM表征结果显示,在此条件下制备出的纳米硒粒径尺寸约为60 nm,颗粒分布均匀且稳定;硒元素占比为12%。2.NPSe-EPS对AFB1诱导的鸡肝细胞体外损伤模型的保护作用研究以鸡肝癌细胞系（LMH）为试验材料,通过检测细胞存活率、凋亡率以及谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）活性和丙二醛（MDA）含量等指标,建立AFB1诱导的鸡肝细胞体外损伤模型。采用不同浓度NPSe-EPS处理细胞,研究NPSe-EPS的毒理作用及其对细胞损伤模型的保护作用。结果显示,用含0.10μg/m L AFB1的细胞培养液孵育LMH 12 h使细胞存活率、AST和ALT活性显著降低（P＜0.05）,而细胞凋亡率和MDA含量显著增加（P＜0.05）,可作为建立肝细胞损伤模型的适宜条件。NPSe-EPS的最低毒性剂量为约为2μM,且此添加剂量下,细胞存活率较AFB1组显著升高（P＜0.05）,而细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）,说明NPSe-EPS对AFB1诱导的鸡肝细胞体外损伤模型具有缓解作用。3.NPSe-EPS对AFB1暴露肉仔鸡肝脏损伤的保护作用研究选择300只1日龄健康的爱拔益加（AA）肉仔鸡,随机分为5个组,每组6个重复,每个重复10只鸡。对照组饲喂基础日粮,其他试验组在基础日粮基础上,分别添加0.10 mg/kg AFB1、0.10 mg/kg AFB1+2 mg/kg NPSe-EPS、0.10 mg/kg AFB1+4mg/kg NPSe-EPS、0.10 mg/kg AFB1+6 mg/kg NPSe-EPS。试验期为21 d,测定肉鸡生长性能、肝脏组织形态结构、血清肝功能指标、肝脏抗氧化酶活性、AFB1残留量、相关基因和蛋白表达等指标。结果表明:与AFB1组相比,在含0.1 mg/kg AFB1的饲粮中分别添加2、4和6 mg/kg NPSe-EPS使肉仔鸡料重比（F/G）显著降低（P＜0.05）,且添加4和6 mg/kg NPSe-EPS使肉仔鸡平均日增重（ADG）显著增加（P＜0.05）;肝脏组织病理学观察发现,肝细胞损伤情况得到缓解。所有NPSe-EPS添加组的血清中总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）和总胆汁酸（TBA）含量均降低至对照组水平;肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性均显著升高（P＜0.05）,而细胞色素P450（CYP450）活性显著降低;此外,添加4和6 mg/kg NPSe-EPS使肝脏中总抗氧化能力（T-AOC）、血红素加氧酶-1（HO-1）活性显著升高（P＜0.05）,且使谷胱甘肽巯基转移酶（GST）和过氧化氢酶（CAT）活性升高至对照组水平;添加4 mg/kg NPSe-EPS使肉仔鸡肝细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）;血清和肝脏中的AFB1残留量及AFBO-DNA加合物含量显著降低（P＜0.05）;肝脏中SOD1、GSTT1、GSTO1、JNK2、p38MAPK、SEPHS2、SELENOT和SELENOW的m RNA相对表达水平显著升高（P＜0.05）,CYP3A4的m RNA相对表达水平显著降低（P＜0.05）;p38MAPK、JNK2、P-Nrf2蛋白相对表达水平显著上调（P＜0.05）。综上所述,本试验探索出NPSe-EPS的适宜制备条件,成功制备出稳定的NPSe-EPS。通过体外和体内试验,发现2μM的NPSe-EPS对体外AFB1诱导的肝损伤模型具有保护作用,4 mg/kg的NPSe-EPS对AFB1暴露肉仔鸡肝脏损伤具有保护作用。该作用主要通过上调硒蛋白表达,激活MAPKs-Nrf2/GST信号通路,抑制I相解毒酶活力并提高II相解毒酶活力,从而促进AFB1在肉鸡肝脏中的解排。上述研究结果对肉鸡生产中开发新型功能性饲料添加剂具有积极科学意义和应用价值。