长期以来，缺乏稳定、高效的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)体外细胞培养系统一直成为制约HCV各项研究深入开展的瓶颈。最近，2a型JFH-1感染性克隆及其衍生的各种HCV体外细胞培养系统的成功构建在某种程度上打破了这一瓶颈，使HCV研究成为当前分子病毒学领域的一个热点。但是，由于HCV感染细胞后不会在短时间内产生明显的易于观察的细胞病理学变化(cytopathogenic effect，CPE)，因此给病毒感染的判定带来诸多不便。　　 绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)是从水母中分离出的一种天然荧光蛋白，分子量约27 KD，由238个氨基酸残基(aa)组成。由于GFP的自发荧光具有无毒害、荧光稳定、易于检测和在不同物种中具有通用性等特点，自发现以来，被广泛做为分子标记应用于分子生物学和细胞生物学的各个领域。在分子病毒学领域，GFP基因也同样得到了广泛应用。如在痘病毒的膜蛋白B5R的C末端融合GFP蛋白，可以实时示踪痘病毒粒子在细胞内的运输过程。而在单纯疱疹病毒HSV基因组中插入GFP基因，可以示踪HSV在小鼠脑组织中的感染和扩散长达5周之久。　　 但是和DNA病毒相比，RNA病毒基因组很小，很难找到容许外源基因插入的位点，外源基因的插入往往会导致基因组复制或组装能力的减弱甚至丧失。为此，有人用高通量的转座子介导的随机插入文库手段来筛选那些RNA病毒基因组中极少的可以允许外源基因插入的位点。Liu等用这种手段在HCV亚复制子Con-1基因组的NS5A编码区发现有两个区域可以容许外源基因的插入而不影响亚复制子基因组的复制。我们通过分析这两个区域对应的JFH-1基因组核苷酸序列发现其中有一个CpoI单酶切位点，并利用此位点将EGFP基因插入到JFH-1基因组中，以示踪HCV在细胞内的感染，同时为揭示HCV细胞内生活周期以及抗HCV药物筛选提供便捷的工具。　　 第一章的综述部分首先介绍了HCV基因组的基本结构及其编码的各个蛋白质分子的结构和功能；其次简要介绍了HCV在细胞内的生活周期；然后详细介绍了HCV体外细胞培养体系的发展过程；接下来介绍了HCV病毒粒子胞内组装相关的研究进展；最后提出了本论文的目的和意义。　　 论文第二章首先对HCV报告病毒的构建和鉴定过程进行了描述。通过在JFH-1非结构蛋白NS5A的C末端插入EGFP基因，获得了具有一定感染性的HCV报告病毒J399E，EGFP和NS5A以融合蛋白的形式表达，起到了示踪作用。接着描述了HCV报告病毒适应性突变株J399EAM的分离和鉴定的过程，证明适应性突变株可以和野生型JFH-1基因组一样高效产生HCV病毒粒子。最后干扰素实验显示J399EAM是一个方便的抗HCV药物筛选的工具。　　 论文第三章主要通过反向遗传学的方法深入分析了HCV报告病毒基因组中适应性突变的作用机理。HCV全基因组序列测定发现J399EAM基因组中有8个核苷酸发生了突变，其中5个突变引起了相应aa的改变：3个aa突变位于NS3的解旋酶区域，2个位于NS5A的c末端，其中NS3的M260K和NS5A的T462I突变是造成J399EAM病毒高感染性的关键性突变。NS3和NS5A的适应性突变以协同方式促进了HCV病毒粒子在细胞内的组装过程，但不影响NS5A在脂滴周围的定位，同时适应性突变在.JFH-1基因组中所产生的效果和在J399E中基本相同。　　 总之，本论文研究成功地分离到了一株含有EGFP报告基因的HCV适应性突变株。此HCV报告病毒的获得将会大大方便一系列与HCV相关的基础和应用研究，同时对适应性突变作用机理的深入分析有助于阐明HCV胞内组装的整个分子过程，为抗HCV药物作用靶点的发现提供理论依据。