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豫粉1号蛋鸡配套系是河南农业大学牵头,河南三高农牧股份有限公司和河南省畜牧总站等单位共同参与培育的一个土种蛋鸡配套系。其中,H系为快羽,性成熟早,产蛋量高,并携带有伴性遗传的哥伦比亚羽,该性状可以作为雏鸡雌性鉴别的一个重要手段。鉴定豫粉1号蛋鸡H系羽色性状表型变异的相关基因和蛋白,从基因表达和转录后调控角度分析豫粉1号蛋鸡H系羽色表型变异的原因,揭示该羽色形成的分子遗传机制。通过日粮中添加酪氨酸分析营养素调控对羽色相关基因表达的影响,利用细胞模型,通过体外酪氨酸处理鸡黑色素细胞试验对筛选的羽色相关基因进行功能验证,确定豫粉1号蛋鸡H系哥伦比业羽的调控基因,为豫粉1号蛋鸡配套系的进一步选育和推广提供依据。
本研究主要取得的结果如下:
1.基于转录组分析豫粉1号蛋鸡H系羽毛再生期羽色相关基因表达规律
对豫粉1号蛋鸡H系20W的鸡进行人工拔毛,14天后选取3只鸡,采集背侧毛囊(A组,颈部背侧黑白条纹羽色)、腹侧毛囊（B组,颈部腹侧白羽）进行RNA-seq分析,共鉴定到21,306个基因,其中,597个是新基因。在A和B组间进行差异分析,共有209个差异表达基因,包括83个上调和126个下调基因。差异表达基因主要富集的色素沉积相关通路包括:Melanogenesis、MAPK pathway、cAMP pathway、PI3K-Akt pathway,cGMP-PKG signaling pathway、Adrenergic signaling in cardiomyocytes和Calcium signaling pathway等信号通路。在Melanogenesis通路中富集的差异表达基因有ASIP、KITLG、PVALB、FZD10、WNT7B、WNT9A、WNT9B、WNT11、LOC396531、CAMK2A和CAMK2B。还发现与色素沉积相关的差异表达基因有SLC45A2、RAB38和MED23。经qRT-PCR验证,SLC45A2、MED23、PVALB、WNT7B、WNT11和FZD10在两组间的表达差异显著（P＜0.05）。
2.基于蛋白组分析豫粉1号蛋鸡H系羽毛再生期羽色变化相关蛋白表达规律
对3只豫粉1号蛋鸡H系鸡羽毛再生期背侧毛囊（A组,颈部背侧黑白条纹羽色）、腹侧毛囊（B组,颈部腹侧白羽）进行iTRAQ高通量测序分析,找寻与豫粉1号蛋鸡H系羽色有关的差异表达蛋白。共鉴定到382个差异表达蛋白,其中差异上调蛋白160个,差异下调蛋白222个。差异上调蛋白中,发现RAB23与黑色素合成有关,DVL3、KRAS、MXRA8、LOC107052863四个差异表达蛋白富集到了Melanogenesis通路中。差异下调蛋白中,发现与黑色素合成有关的蛋白GNAQ,Melanogenesis通路中富集的差异下调蛋白有GNAQ、PVALB、PLCB1、CAMK2A、CAMK2B。
3.转录组与蛋白组联合分析豫粉1号蛋鸡H系羽毛再生期羽色相关基因/蛋白的表达
对3只豫粉1号蛋鸡H系鸡的羽毛再生期背侧毛囊（A组,颈部背侧黑白条纹羽色）、腹侧毛囊（B组,颈部腹侧白羽）的382个差异表达蛋白和209个差异表达基冈关联分析,发现49个在mRNA和蛋白质水平显著差异的基因。其中,PVALB、CAMK2A和CA MK2B基因在mRNA水平和蛋白质水平都显著差异。差异基因和差异蛋白富集的色素沉积相关通路包括Melanogenesis、calcium signaling pathway、cGMP-PKG signaling pathway和adrenergic signaling in cardiomyocytes等。Melanogenesis通路富集了5个差异表达蛋白(PLCB1、LOC107052863、PVALB、CAMK2A、CAMK2B)和11个差异表达基因ASIP、KITLG、PVALB、FZD10、WNT7B、WNT9A、WNT9B、WNT11、LOC396531、CAMK2A和CAMK2B。
4.日粮中添加酪氨酸对豫粉1号蛋鸡H系羽色变化相关基因表达的影响
以200只豫粉1号蛋鸡H系20W的鸡为试验对象,在日粮中添加不同水平酪氨酸(0.4％、0.6％、0.8％和1.0％)可提高血清中酪氨酸酶的含量。日粮中添加0.8％和1.0％酪氨酸的H系鸡羽毛中黑色羽颜色显著加深（P＜0.05）。结果表明在日粮中添加酪氨酸可提高血清中酪氨酸酶的含量,影响羽毛中黑色素的沉积。
选取豫粉1号蛋鸡H系对照组和处理组（1.0％酪氨酸）各3只鸡,利用高通量测序技术,分别对添加酪氨酸处理组H系鸡背侧毛囊(TB)、腹侧毛囊(TF),对照组H系鸡背侧毛囊(CB)、腹侧毛囊(CF)进行RNA-seq分析,共鉴定到18,360个基因,预测新基因为775个。在CB和TB组间分析发现,共有659个差异表达基因,包括253个上调差异基因和406个下调差异基因。在CF与TF组问分析发现,共有差异表达基因501个。表达上调的基因有250个,表达下调的基因有251个。差异表达基因主要富集的与色素沉积相关通路包括:Melanogenesis、MAPK pathway、cAMP pathway、PI3K-Akt pathway,cGMP-PKG signaling pathway、Adrenergic signaling in cardiomyocytes、Wnt signaling pathway、mTOR signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway和Calcium signaling pathway。在Melanogenesis通路中的差异表达基因EDNRB2、GNAQ、WNT3、WNT11、PRKCB、WNT16、CALM和PVALB。经qRT-PCR验证,EDNRB2、GNAQ、WNT3、WNT11、PRKCB、PVALB在CB与TB组间的表达差异显著,GNAQ和WNT3在CF与TF组间表达差异显著。
5.豫粉1号蛋鸡H系羽色相关候选基因的时空表达分析
对豫粉1号蛋鸡H系鸡毛囊进行RNA-seq和iTRAQ测序,挑选与羽色相关候选基因SLC45A2、MED23、EDNRB2、PRKCB、WNT3、WNT7B、WNT11、FZD10和PVALB进行时空表达谱分析。发现在0～12W的H系鸡的颈部背侧毛囊组织中,SLC45A2的绝对表达量最高,在8W相对表达量最高,MED23的相对表达量在8W也达到了最高。对不同生长期的豫粉1号蛋鸡H系毛囊组织的时空表达谱分析,发现EDNRB2和PRKCB表达量在10W达到了最高值,WNT7B、WNT11和FZD10的表达量在8W达到了最高值。我们认为SLC45A2、MED23、EDNRB2、PRKCB、WNT7B、WNT11和FZD10基因可能与豫粉1号蛋鸡H系的羽色形成的有关。
6.酪氨酸处理鸡黑色素细胞对黑色素合成相关基因的影响
为了验证候选基因SLC45A2、MED23、EDNRB2、PRKCB、FZD10、WNT11和WNT7B是否与黑色素的合成有关,我们用酪氨酸处理鸡黑色素细胞分析候选基因的表达量变化情况。我们发现,在10-6mol/L时,体外培养的鸡黑色素细胞的EDNRB2和PRKCB基因的mRNA的表达量最高,并且与对照组(0mol/L)及处理组10-9mol/L、10-8mol/L和10-7mol/L差异显著(P＜0.05);在10-8mol/L浓度时,SLC45A2基因的表达量有明显增加,与对照组(0mol/L)及处理组10-7mol/L和10-6mol/L差异显著;在10-7mol/L时,MED23基因的表达量最高,并且与对照组(0mol/L)及处理组10-9mol/L、10-8mol/L和10-6mol/L差异显著。试验证明,通过体外添加酪氨酸,可以影响鸡黑色素细胞中与黑色素合成相关基因的表达发生改变,SLC45A2、EDNRB2、PRKCB和MED23基因在酪氨酸的影响下,可以调控黑色素细胞内黑色素的合成。
羽色是由多基因控制的性状,综合分析,我们认为主要由SLC45A2、EDNRB2、PRKCB、MED23参与调控了豫粉1号蛋鸡H系哥伦比亚羽色形成。
本研究主要取得的结果如下:
1.基于转录组分析豫粉1号蛋鸡H系羽毛再生期羽色相关基因表达规律
对豫粉1号蛋鸡H系20W的鸡进行人工拔毛,14天后选取3只鸡,采集背侧毛囊(A组,颈部背侧黑白条纹羽色)、腹侧毛囊（B组,颈部腹侧白羽）进行RNA-seq分析,共鉴定到21,306个基因,其中,597个是新基因。在A和B组间进行差异分析,共有209个差异表达基因,包括83个上调和126个下调基因。差异表达基因主要富集的色素沉积相关通路包括:Melanogenesis、MAPK pathway、cAMP pathway、PI3K-Akt pathway,cGMP-PKG signaling pathway、Adrenergic signaling in cardiomyocytes和Calcium signaling pathway等信号通路。在Melanogenesis通路中富集的差异表达基因有ASIP、KITLG、PVALB、FZD10、WNT7B、WNT9A、WNT9B、WNT11、LOC396531、CAMK2A和CAMK2B。还发现与色素沉积相关的差异表达基因有SLC45A2、RAB38和MED23。经qRT-PCR验证,SLC45A2、MED23、PVALB、WNT7B、WNT11和FZD10在两组间的表达差异显著（P＜0.05）。
2.基于蛋白组分析豫粉1号蛋鸡H系羽毛再生期羽色变化相关蛋白表达规律
对3只豫粉1号蛋鸡H系鸡羽毛再生期背侧毛囊（A组,颈部背侧黑白条纹羽色）、腹侧毛囊（B组,颈部腹侧白羽）进行iTRAQ高通量测序分析,找寻与豫粉1号蛋鸡H系羽色有关的差异表达蛋白。共鉴定到382个差异表达蛋白,其中差异上调蛋白160个,差异下调蛋白222个。差异上调蛋白中,发现RAB23与黑色素合成有关,DVL3、KRAS、MXRA8、LOC107052863四个差异表达蛋白富集到了Melanogenesis通路中。差异下调蛋白中,发现与黑色素合成有关的蛋白GNAQ,Melanogenesis通路中富集的差异下调蛋白有GNAQ、PVALB、PLCB1、CAMK2A、CAMK2B。
3.转录组与蛋白组联合分析豫粉1号蛋鸡H系羽毛再生期羽色相关基因/蛋白的表达
对3只豫粉1号蛋鸡H系鸡的羽毛再生期背侧毛囊（A组,颈部背侧黑白条纹羽色）、腹侧毛囊（B组,颈部腹侧白羽）的382个差异表达蛋白和209个差异表达基冈关联分析,发现49个在mRNA和蛋白质水平显著差异的基因。其中,PVALB、CAMK2A和CA MK2B基因在mRNA水平和蛋白质水平都显著差异。差异基因和差异蛋白富集的色素沉积相关通路包括Melanogenesis、calcium signaling pathway、cGMP-PKG signaling pathway和adrenergic signaling in cardiomyocytes等。Melanogenesis通路富集了5个差异表达蛋白(PLCB1、LOC107052863、PVALB、CAMK2A、CAMK2B)和11个差异表达基因ASIP、KITLG、PVALB、FZD10、WNT7B、WNT9A、WNT9B、WNT11、LOC396531、CAMK2A和CAMK2B。
4.日粮中添加酪氨酸对豫粉1号蛋鸡H系羽色变化相关基因表达的影响
以200只豫粉1号蛋鸡H系20W的鸡为试验对象,在日粮中添加不同水平酪氨酸(0.4％、0.6％、0.8％和1.0％)可提高血清中酪氨酸酶的含量。日粮中添加0.8％和1.0％酪氨酸的H系鸡羽毛中黑色羽颜色显著加深（P＜0.05）。结果表明在日粮中添加酪氨酸可提高血清中酪氨酸酶的含量,影响羽毛中黑色素的沉积。
选取豫粉1号蛋鸡H系对照组和处理组（1.0％酪氨酸）各3只鸡,利用高通量测序技术,分别对添加酪氨酸处理组H系鸡背侧毛囊(TB)、腹侧毛囊(TF),对照组H系鸡背侧毛囊(CB)、腹侧毛囊(CF)进行RNA-seq分析,共鉴定到18,360个基因,预测新基因为775个。在CB和TB组间分析发现,共有659个差异表达基因,包括253个上调差异基因和406个下调差异基因。在CF与TF组问分析发现,共有差异表达基因501个。表达上调的基因有250个,表达下调的基因有251个。差异表达基因主要富集的与色素沉积相关通路包括:Melanogenesis、MAPK pathway、cAMP pathway、PI3K-Akt pathway,cGMP-PKG signaling pathway、Adrenergic signaling in cardiomyocytes、Wnt signaling pathway、mTOR signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway和Calcium signaling pathway。在Melanogenesis通路中的差异表达基因EDNRB2、GNAQ、WNT3、WNT11、PRKCB、WNT16、CALM和PVALB。经qRT-PCR验证,EDNRB2、GNAQ、WNT3、WNT11、PRKCB、PVALB在CB与TB组间的表达差异显著,GNAQ和WNT3在CF与TF组间表达差异显著。
5.豫粉1号蛋鸡H系羽色相关候选基因的时空表达分析
对豫粉1号蛋鸡H系鸡毛囊进行RNA-seq和iTRAQ测序,挑选与羽色相关候选基因SLC45A2、MED23、EDNRB2、PRKCB、WNT3、WNT7B、WNT11、FZD10和PVALB进行时空表达谱分析。发现在0～12W的H系鸡的颈部背侧毛囊组织中,SLC45A2的绝对表达量最高,在8W相对表达量最高,MED23的相对表达量在8W也达到了最高。对不同生长期的豫粉1号蛋鸡H系毛囊组织的时空表达谱分析,发现EDNRB2和PRKCB表达量在10W达到了最高值,WNT7B、WNT11和FZD10的表达量在8W达到了最高值。我们认为SLC45A2、MED23、EDNRB2、PRKCB、WNT7B、WNT11和FZD10基因可能与豫粉1号蛋鸡H系的羽色形成的有关。
6.酪氨酸处理鸡黑色素细胞对黑色素合成相关基因的影响
为了验证候选基因SLC45A2、MED23、EDNRB2、PRKCB、FZD10、WNT11和WNT7B是否与黑色素的合成有关,我们用酪氨酸处理鸡黑色素细胞分析候选基因的表达量变化情况。我们发现,在10-6mol/L时,体外培养的鸡黑色素细胞的EDNRB2和PRKCB基因的mRNA的表达量最高,并且与对照组(0mol/L)及处理组10-9mol/L、10-8mol/L和10-7mol/L差异显著(P＜0.05);在10-8mol/L浓度时,SLC45A2基因的表达量有明显增加,与对照组(0mol/L)及处理组10-7mol/L和10-6mol/L差异显著;在10-7mol/L时,MED23基因的表达量最高,并且与对照组(0mol/L)及处理组10-9mol/L、10-8mol/L和10-6mol/L差异显著。试验证明,通过体外添加酪氨酸,可以影响鸡黑色素细胞中与黑色素合成相关基因的表达发生改变,SLC45A2、EDNRB2、PRKCB和MED23基因在酪氨酸的影响下,可以调控黑色素细胞内黑色素的合成。
羽色是由多基因控制的性状,综合分析,我们认为主要由SLC45A2、EDNRB2、PRKCB、MED23参与调控了豫粉1号蛋鸡H系哥伦比亚羽色形成。