急性肺损伤(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫综合(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是临床常见的呼吸系统危重疾病,发展快,病死率高,社会危害重。ALI和ARDS常由创伤、感染、脓毒症、休克、体外循环和广泛的烧伤等因素引起。ALI患者如果不及时治疗常发展为ARDS。 ARDS患者常表现为呼吸困难和难以纠治的低氧血症,患者死亡率高。目前为止,ALI和ARDS的临床治疗策略主要有呼吸支持、感染预防、严格控制液体输入,此外肺保护性药物的应用也有助于患者的恢复,例如吸入肺泡表面活性物质、N0、糖皮质激素、抗氧化剂等手段,但疗效依然十分有限。ALI和ARDS患者的预后也因原发病的不同而有所差异,全身感染引发的ALI患者如果发展成为ARDS预后往往很差；骨髓移植患者机体抵抗力降低,如果并发ARDS死亡率往往100%。目前ALI和ARDS的发病率和死亡率依然很高,危害重,对新治疗策略的需求依然十分迫切。细胞治疗被认为是一种潜在、有前景的治疗方法。目前间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)用于肺部疾病的基础研究和治疗多有报道,国内外研究学者从不同角度探讨MSC用于ALI和ARDS治疗的作用机制。尽管有关干细胞用于ALI治疗的基础研究报道较多,但机制仍未完全阐明。MSC最早发现于骨髓,在胎盘、脐带和羊水中也相继发现。根据既往研究结果认为MSC具有自我复制、免疫调节、多向分化潜能,例如分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。MSC在体外培养过程呈贴壁生长,类成纤维样.间充质干细胞阳性表达CD73、CD29、CD90和CD105等细胞表面标记物,阴性表达CD34、 CD11b、C14和CD45等。越来越多的研究报道MSC在创伤、心脏、皮肤、整形、烧伤等医学领域应用前景广泛,通过其损失修复、再生等机制为临床提供更多的治疗选择。截至目前有关干细胞的应用不断报道,例如骨髓来源的干细胞通过静脉注射、气管注入等途径可迁入炎症部位,在微环境中表达原位细胞的特异蛋白；另据报道在给予MSCs后,MSCs可以移入机体的炎症反应部位,缓解炎症反应,减轻炎症损伤。近来报道MSC分泌的因子具有修复受损的细胞、组织等功能而受到重视。近来间充质干细胞应用于骨组织、软骨组织、关节和心肌细胞损伤后的修复等基础研究报道较多。据报道MSCs经静脉注入小鼠体内后可以移入肺内并表达肺泡上皮细胞的特性和标记物；研究报道MSC具有免疫调节功能,MSCs可以减少促炎因子的释放,增加抗炎因子的产生从而达到减轻肺损伤的作用；MSC可以分泌可溶性因子如KGF、EGF和LL-37等,部分因子具有修复受损肺泡毛细血管膜,减低肺泡毛细血管通透性,从而达到修复急性肺损伤的作用；目前研究表明MSC移入受损部位的比率较低,以此解释MSC修复ALI的可能性较小；MSC通过免疫调节作用在一定程度缓解了ALI的损伤,但仍不能完全解释其修复ALI的作用机制。在肺泡上皮细胞发挥重要的作用,如肺二型上皮细胞(alveolar epithelial cell type Ⅱ, AT-Ⅱ)分泌肺泡表面活性物质降低肺泡表面张力；通过转运钠离子清除肺泡内残留液体以保持肺泡内干燥。MSC可能通过修复炎症损伤的肺二型上皮细胞发挥其修复作用。肺泡上皮细胞在肺泡液清除过程发挥重要作用,肺泡上皮细胞清除肺泡内电解质和水分子的作用被定义为(Alveolar fluid clearance, AFC), MSC分泌的生长因子可能具有促进肺泡上皮细胞的转运离子和水分子功能,从而保持肺泡的干燥。AFC对于判断病人的预后有重要的参考价值,ALI过程合并AFC的受损,AFC与患者的死亡率密切相关。AT-Ⅱ与肺一型上皮细胞(alveolar epithelial cell type Ⅰ, AT-Ⅰ)均有转运肺泡内液体的功能,尤其AT-Ⅱ发挥重要作用。正常的肺水清除过程AT-Ⅱ顶端的钠离子通道、水通道以及细胞底部的钠钾ATP酶(sodium-potassium adenosine triphosphatase, Na-K-ATPase)均参与肺水的清除,在转运过程中钠通道和Na-K-ATPase发挥重要作用。在炎症过程肺泡毛细血管膜在促炎症介质白介素(IL-1 β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和干扰素(IFN-γ)等作用后造成肺泡毛细血管膜损伤,肺泡内出现渗出性改变,肺泡毛细血管膜增厚,二氧化碳及氧气的弥散距离增加；AT-Ⅱ分泌肺泡表面活性物质减少,肺顺应性下降,通气障碍。AT-Ⅱ细胞和AT-Ⅰ细胞转运能力下降。所以本课题基于MSCs缓解炎症反应,降低急性肺损伤,但MSCs修复受损的AFC报道较少,机制不明。AT-Ⅱ细胞受损后AFC能力降低,AFC对判断患者的预后有重要参考价值,所以探明MSCs旁分泌机制修复肺上皮细胞的AFC能力具有重要的意义。研究方法1.骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定：麻醉并处死SD大鼠,分离大鼠股骨及胫骨骨髓腔内细胞至培养皿,细胞贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-MSC, BM-MSC).24小时后更换培养基,此后每三天刚换一次培养基,放置细胞孵箱内培养(5%C02,37℃)。细胞生长至80%酶消化法传代,3-6代细胞用于实验。应用流式细胞术检测技术鉴定细胞表面标记物,使用成脂及成骨诱导培养基培养BM-MSCs,鉴定MSC多项分化潜能。单克隆实验鉴定细胞自我复制能力,应用流式细胞技术检测BM-MSC表面标记物。2.肺二型上皮细胞的分离培养及鉴定：麻醉并处死SD大鼠,消毒、抗凝后放置超净台。打开胸腔,冲洗肺循环至肺组织发白。剪出肺组织使用PBS液冲洗肺远端气道。利用胰蛋白酶消化、差速离心、细胞贴壁的方法分离大鼠AT-Ⅱ细胞。DMEM/F12培养细胞,利用免疫荧光技术,肺泡表面活性物质(surfactant protein A, SP-A)鉴定大鼠AT-Ⅱ细胞。3.共培养模型的建立：本实验探索MSCs旁分泌机制修复受损后的AT-Ⅱ细胞,建立共培养体系。4. AT-Ⅱ细胞细胞增殖实验：利用CCK-8试剂检测AT-Ⅱ在炎症刺激后增殖情况以及共培养后MSCs对AT-Ⅱ细胞的影响作用。首先AT-Ⅱ(1×10‘)于上室培养,建立炎症环境,构建炎症环境的三个主要促炎症因子TNF-α、IL6和IL1-β,因子浓度分别为1.7ng/ml,87.6ng/ml和4.4ng/ml用以损伤AT-Ⅱ;正常培养基DMEM/F12培养AT-Ⅱ细胞作为阴性对照；MSCs与炎症刺激后的AT-Ⅱ共培养。连续观察72h测定细胞增殖,应用酶标仪(450nm)测定光密度。5.KGF分泌以及KGF-SiRNA干扰效率分析：MSC促进炎症刺激后AT-Ⅱ的增殖活性。我们建立了如下四种共培养体系,各组的实验条件如下：①MSCs, ②MSCs+cytomix, ③MSCs+AT-Ⅱ细胞,④AT-Ⅱ cells+ cytomix。下小室培养MSCs,或在上小室内培养AT-Ⅱ。共培养48小时取培养基上清,利用ELISA方法测定KGF的分泌。利用lipofectamine 2000为载体转染KGF-SiRNA,在转染48小时后测定KGF分泌水平,了解SiRNA的干扰效率。Cytomix包括TNF-α、IL6和IL1-β等炎症因子。6. MSCs静脉注入大鼠肺内示踪：利用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) (10mg/kg)经鼠尾静脉注射构建大鼠ALI模型,4h后经鼠尾静脉注射DiI标记的MSCs (5×105)。MSCs注射后15min,2h,24hand 72h分别麻醉并处死大鼠,获取肺组织,利用小动物成像技术分析MSCs注射大鼠体内后肺内留存。同时制作15min,24h and 72h时间点的肺组织冰冻切片,了解MSCs在注射大鼠肺组织后肺内分布。7.病理评价及肺湿/干比：7-8周的大鼠随机分配成6组,第一组大鼠注射PBS液;第二组注入LPS,4h后注射PBS;第三组注射LPS,4h后注射MSCs;第四组注射LPS,4h后注射KGF-SiRNA;第五组注射LPS,4h后注射lipofectamine 2000;第六组注射72h后麻醉并处死大鼠并获取肺组织,右侧肺叶制作石蜡切片并HE染色,左肺叶测湿/干重。8.α1和β1亚基的蛋白及基因分析：建立体外共培养体系,体外实验条件如下：AT-Ⅱ细胞+PBS(对照组),炎症攻击AT-Ⅱcells + PBS,3) AT-II细胞+MSCs,4)炎症攻击AT-Ⅱ细胞+MSCs,5)炎症攻击AT-Ⅱ细胞+MSCs(KGF-siRNA),6)炎症攻击AT-Ⅱ细胞+MSCs-lipof。模拟炎症环境TNF-α、IL6 and IL1-β (1.7ng/ml,87.6ng/ml and 4.4ng/ml)。共培养72h后分别应用蛋白免疫印迹(Western blot)及实时定量聚合酶联反应(quantitative polumerase chain reaction, qPCR)分析Na-K-ATPase α1和β1亚基的改变。9. PI3K/Akt/mTOR信号通路分析：为进一步分析MSCs修复AT-Ⅱ的可能机制。通过Western blot分析MSCs与AT-Ⅱ cells共培养后AT-Ⅱ的蛋白p-AKT、 AKT、p-mTOR和mTOR改变。10.统计学分析：本试验数据均为计量资料,所有数据表达为X±SD,采用SPSS13.0分析软件。单组计量资料采用采用one-sample t test; 3组以上独立样本采用单因素方差分析(One-way ANOVA),进一步多重比较采用LSD；重复测量资料采用重复测量数据方差分析,P<0.05认为差异有统计学意义。结果：1.大鼠BM-MSC在培养皿呈贴壁、成纤维样生长。3-8代的骨髓间充质干细胞用于实验。细胞稳定表达CD29, CD44, CD90和CD105,阴性表达CD34 and CD45。BM-MSC从单个细胞到克隆形成,提示其自我复制能力。脂肪诱导及成骨诱导培养后鉴定呈阳性。肺二型上皮细胞经分离培养后呈现圆形、铺路石样贴壁生长。经肺泡表面活性物质A(surfactant protein A, SP-A)抗体标记,免疫荧光检测呈阳性表达。2.CCK-8方法测定AT-Ⅱ细胞在炎症损伤后,细胞增殖呈现下调趋势；AT-Ⅱ与MSCs经共培养后细胞增殖呈现上调趋势。提示MSCs通过旁分泌作用促进AT-Ⅱ细胞的增殖。3.MSC在无血清DMEM/F12条件下培养48小时检测KGF浓度为437.65 pg/ml,炎症刺激后KGF浓度为884.17 pg/ml;当MSCs与AT-Ⅱ细胞共培养条件下KGF浓度为382.37 pg/ml; AT-Ⅱ分泌KGF浓度明显较少。说明在二者的共培养体系内MSCs是KGF的主要来源。使用cy5标记的SiRNA转染MSCs,结果提示大多数MSCs被成功转染SiRNA。MSCs被转染KGF-SiRNA后,KGF的分泌明显降低。4.DiI标记MSCs经鼠尾静脉注入大鼠体内。小动物成像技术观察注射后15min肺内有大量的MSCs存留,但在2h和24h时间点MSCs在肺内逐步减少,72h肺内依然有MSCs留存,但细胞光强值明显下降。冰冻切片提示注射后15min肺内MSCs呈聚集现象,在24h与72h时间点细胞在肺内散在分布,在肺泡内可见DiI标记的MSCs5.大鼠鼠尾静脉注射LPS病理结果提示肺泡内炎性渗出和肺泡间隔增厚。注射MSCs后肺泡炎性渗出液减少和肺泡间隔变小。KGF-SiRNA转染MSC后,MSC的治疗作用减弱。肺组织湿/干比在大鼠注入LPS后升高。继LPS鼠尾静脉注入MSCs湿/干下降,LPS后大鼠注入KGF-SiRNA转染的MSCs,湿/干比上升。6.α1和β1亚基在炎症因子损伤下,在蛋白和基因水平二者的表达均下降。与MSCs共培养48小时,α1和β1表达上调。炎症刺激下的AT-Ⅱ细胞与KGF-SiRNA干扰后的MSCs培养后,α1亚基表达明显下调,然而β1亚基无明显的改变。提示MSC可能通过KGF的分泌促进α1亚基的表达而非β1亚基。同时MSC促进了AT-Ⅱ细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路p-AKT和p-mTOR蛋白的改变。结论1. MSCs在炎性条件比非炎性条件分泌更多的KGF。DiI标记的MSCs注入大鼠体内,早期肺内留存较多,后逐步下降,在注射后72后MSCs在肺内依然有存留。2.大鼠注入LPS后肺内炎性渗出增加,湿/干比升高,注入MSCs后肺泡内液体消失,湿/干比重下调,MSC可能通过促进AFC的作用减轻大鼠的记性肺损伤。3.体外共培养结果提示MSCs分泌的KGF促进了AT-Ⅱ细胞Na-K-ATPaseα1表达,而β 1亚基无明显的改变。4.MSC可能通过激活KGF-dependent的PI3K/Akt/mTOR信号通路从而促进细胞增殖和α1亚基的表达。