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热量限制(CaloricRestriction,CR)是指在保证机体获得充足的营养成分如糖类、必需氨基酸、维生素等,并且在生物体不发生营养不良的基础上,限制每日摄入的总热量的一种饮食方式,因此也被称为限饲。在1935年,热量限制就已被证实能够使大鼠的寿命显著延长。热量限制在种畜禽生产中应用广泛,适时适度限饲不但能够提高饲料利用率,节约饲料成本,而且能够降低体脂沉淀,提高瘦肉率,改善肉品质。但是热量限制对生殖的影响结论尚不统一。美国国家灵长类动物研究中心研究发现,70%猕猴热量限制模型中血清睾酮下降趋势没有表现出与热量限制的相关性。而NORAMBUENA等证实了中重度的热量限制对生殖功能有抑制作用。本试验通过建立热量限制(60%)Wistar大鼠模型,基于GC/TOF-MS代谢组学技术,结合形态学和氧化酶指标,对热量限制影响雄性大鼠睾丸生殖功能影响的可能作用机制进行较为系统的研究。实验一:热量限制对雄性大鼠睾丸组织内源性代谢物的影响。本试验通过建立短期和长期热量限制大鼠模型,并基于气相色谱飞行时间质谱联用技术(GC/TOF-MS)对热量限制干预后的大鼠睾丸组织样本进行测定,得到代谢物图谱,并基于多元及单元统计分析方法,筛选出差异表达的代谢物。结果表明,经过短期热量限制,青年大鼠睾丸组织代谢水平和对照组有一定分离的趋势,但没有完全分离。而长期热量限制后,中年大鼠睾丸组织代谢水平和对照组有统计学意义上的分离。但是无论是短期热量限制还是长期热量限制,其脂肪酸合成代谢水平显著下调,能量代谢水平和氨基酸代谢水平没有显著下调,反而显著上调。这表明适度热量限制不会使睾丸组织因营养缺乏而导致能量代谢下降,仅仅会抑制储能性脂肪酸的合成,不会影响机体氨基酸代谢系统和能量代谢系统的正常运转,甚至可以一定程度上促进代谢水平的升高。此外,由于苹果酸、谷氨酸、脱氢抗坏血酸和茶氨酸等代谢水平的提高,我们推测热量限制可能会增强睾丸组织抗氧化的能力,减少生殖细胞遭受氧化累积的损害,在一定程度上可以促进生殖细胞的生长和发育,延长生殖寿命。实验二:热量限制对雄性大鼠睾丸形态和抗氧化能力的影响。本试验结合形态学、理化指标及分子生物学方法探讨热量限制对雄性大鼠睾丸形态和抗氧化能力的影响。结果发现,经过短期热量限制,短期热量限制青年大鼠体重上升趋势减缓,精神状态好于对照组。曲细精管生长良好,基膜完整,管内各级生精细胞排列整齐,生精上皮普遍可见有6～8层各级生殖细胞。短期热量限制组与对照组相比,睾丸组织中ZO-1 mRNAs表达显著升高,同时在免疫荧光结果中观察到睾丸组织中血睾屏障紧密连接ZO-1蛋白有较强的阳性反应。此外,短期热量限制组睾丸组织相较于对照组丙二醛(MDA)含量显著降低(P<0.05),超氧化酶歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活力显著升高(P<0.05);短期热量限制组相较于对照组抗氧化编码基因SOD、CAT、GST和Nrf2mRNAs水平显著升高(P<0.05)。而在长期热量限制中年雄性大鼠试验中发现,自由采食(对照组)的雄性大鼠到达80周龄时,死亡两只,另有三只大鼠身体出现肿瘤,且对照组大鼠普遍精神状态较迟钝。在形态学上发现对照组大鼠睾丸组织曲细精管收缩,管腔直径缩小,管腔内生殖细胞层数仅有3～4层,腔内生成的精子也较少;在透射电子显微镜下,可见生殖细胞皱缩,线粒体肿胀,胞浆内出现空泡,染色质边集化,出现凋亡趋势;此外,睾丸组织血睾屏障的紧密连接蛋白ZO-1的免疫荧光试验中有较弱的阳性反应。而长期热量限制组大鼠在80周龄全部存活,未出现死亡或者肿瘤现象;睾丸组织曲细精管完整,有5～8层不同阶段的生殖细胞,腔内精子较多;其超微结构也未见明显病变,线粒体较完整,核内染色质均匀,未见凋亡现象;睾丸组织中血睾屏障的ZO-1免疫荧光染色有较强的阳性反应,睾丸组织的ZO-1 mRNAs表达也显著升高;在抗氧化酶指标试验中,长期热量限制组相较于对照组,丙二醛(MDA)含量显著下降,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)酶的活力显著提高,分子水平上的SOD、CAT、GST和Nrf2等抗氧化基因mRNAs表达水平上调。这说明适度热量限制(60%)雄性大鼠,在一定程度上有利于睾丸内细胞的生长和发育,能够缓解因年龄积累导致的氧化损伤和相关疾病的产生,对于延长生殖寿命有积极的作用。