目的:目前听力损失是影响全球人类健康的重要原因之一,据2013年世界卫生组织(The Word Health,WHO)数据调查结果显示,目前全世界听力障碍患者大约有36,000万,约占总人口的5.3%,其中15岁以下听障患儿约有3,200万。根据病因可以将听力损失分为先天性和后天性两种,其中先天性听力损失主要包括遗传性聋,而后天性听力损失主要包括噪声诱导的听力损失、耳毒性药物诱导的听力损失以及老年性聋等。因此,尽早完善与听力损失相关的基因突变谱,并通过基因筛查与诊断提早进行患病风险的评估和预防,将对最终降低我国人口听力损失发病率、提高人口质量具有重大意义。不论是先天性还是后天性,导致最终听力损失的原因都是阻断了声音在听觉传导通路的正常传递。听觉传导通路主要分为外周听觉传导通路和中枢传导通路,其中外周听觉系统传导通路为:外界声音从外耳道通过鼓膜,将声音传递至中耳,再通过听小骨振动将声音信号放大并传递至卵圆窗,并通过淋巴液的振动传递刺激耳蜗Corti器。中枢神经系统正常传导通路为:耳蜗Corti器中的外毛细胞接受到刺激之后将声音信号放大,刺激内毛细胞将声音信号通过突触进行编码,然后沿着耳蜗核-下丘-内侧膝状体-大脑听皮层传递,最终完成了声音信号在中枢听觉传导通路中的完整传递。近年来,介于外周和中枢听觉传导通路中间的耳蜗带状突触逐渐成为耳神经外科学基础研究领域的热点,与中枢神经系统内的突触有所不同,耳蜗内毛细胞带状突触是将声音信号向中枢传递过程中的第一个突触结构,并且因为其空间分布呈带状故称之为“带状突触”(Ribbon Synapses)。声音信号从外周听觉系统向中枢听觉系统的传导依赖于耳蜗带状突触内神经递质快速、精确、及时地释放,这也决定了声音信号传递的质和量。此外,在声音信号在听觉系统传递的过程中,耳蜗内毛细胞负责将声波的机械信号转换为电信号,然后再通过耳蜗带状突触传递到中枢听觉神经元。因此,在这个过程中,任何可能导致带状突触结构和功能改变的危险因素如噪声、耳毒性药物、老化等,都会对声音的编码产生重要的影响。目前,隐匿性听力损失已经成为一种被广为认可的以耳蜗带状突触损伤为主要病理机制的临床常见疾病。患者的临床表现主要为听阈无明显变化,在嘈杂环境中却表现出言语识别率显著降低。为了深入探索其发病机制,有学者通过给予实验动物中度程度噪声暴露,可导致暂时性阈移(Temporary Threshold Shift,TTS)、耳蜗带状突触不可逆性损伤以及ABR的I波幅值不可逆性下降的特征,与临床表现相一致,认为其可作为噪声诱导的隐匿性听力损失(Noise-induced Hidden Hearing Loss,NIHHL)动物模型。对于其发病机制,目前被广为认同的观点是中等程度噪声暴露仅损伤高阈值、低自发放电率的听神经纤维,而基本不损伤低阈值、高自发放电率的听神经纤维,而高阈值、低自发放电率的听神经纤维的功能主要是调节嘈杂环境中的言语识别率,而未受损伤的低阈值、高自发放电率的听神经可以继续维持正常听阈。因此,在隐匿性听力损失发病过程中,中等强度噪声可直接损伤内毛细胞与高阈值、低自发放电率听神经纤维之间的耳蜗带状突触,进而导致高阈值、低自发放电率听神经与内毛细胞失去连接,丧失其功能,从而导致患有隐匿性听力损失患者表现出在嘈杂环境中言语识别率降低,但是不影响阈值变化的临床特征。尽管如此,目前隐匿性听力损失的分子机制尚未明确。成纤维细胞生长因子22(Fibroblast growth factor 22,Fgf22)基因在2001年被首次克隆。既往研究发现,Fgf22基因与哺乳动物胚胎期大脑发育、中枢神经系统兴奋性突触的形成、维持与调控等都有着密切的联系。最近研究显示Fgf22基因可通过维持耳蜗带状突触数量而拮抗庆大霉素耳毒性导致的听力损失,推测Fgf22可能与听觉系统耳蜗带状突触密切相关。因此,本研究旨在探讨Fgf22基因在听觉传导通路中的作用,并明确Fgf22基因是否与隐匿性听力损失密切相关,以及分子机制的深入探索。此外,转录组学RNA-seq技术近年来在基础研究领域十分兴起,主要原因是其可以在特定的发育阶段或生理条件下通过获取完整的转录因子及数量的变化差异,从而揭示细胞和组织内的分子组成,进而有助于理解发育和疾病的意义,即可以直接从分子水平阐述疾病的分子机制。其中长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)被应用得尤为广泛,它是一类大于200个核苷酸的非蛋白编码RNA,可以通过调控转录等蛋白编码过程,从而在多种疾病中发挥重要的作用。因此,本研究将采用RNA-seq技术深入探讨本研究中所涉及到的分子机制研究。方法:1.在正常成年小鼠中,通过免疫荧光染色明确Fgf22基因在听觉传导通路中的时空表达特征;在P0、P7、P14、P28四个时间点,通过耳蜗基底膜铺片免疫荧光染色的方法明确Fgf22基因在听觉传导通路中的时空表达特征;2.通过CRISPR/Cas9技术构建Fgf22基因敲除小鼠后,首先通过PCR扩增产物进行基因测序以鉴定小鼠的基因型,从而明确Fgf22基因敲除成功,然后观察与评估不同基因型小鼠的繁殖能力、体重变化等生长发育特征;3.通过听觉脑干反应(Auditory Brain Response,ABR)明确Fgf22基因敲除小鼠模型在不同频率上的听力学表型;4.分别对Fgf22基因敲除小鼠与野生型小鼠给予100分贝(Decibel,dB)声压级(Sound Pressure Level,SPL)的中等强度白噪声暴露2小时,观察噪声暴露后各组小鼠的听力学表型差异,以及通过免疫荧光染色观察耳蜗带状突触数量的变化差异;5.构建中等强度噪声暴露导致的隐匿性听力损失小鼠动物模型,设置一次暴露(The First Time of Noise Exposure,NE-1st)组,即 NIHHL 模型,二次暴露(The Second Time of Noise Exposure,NE-2nd)组,即噪声性听力损失(Noise-induced hearing loss,NIHL)模型、空白对照组,对 NE-1st 组合 NE-2nd 组分别给予100dB SPL白噪声暴露2小时暴露1次和暴露2次,并在噪声暴露后第1天、第7天、第14天对其进行ABR阈值变化检测、ABRI波幅值变化检测以及通过免疫荧光染色观察耳蜗带状突触数量变化情况;6.在噪声暴露后第14天,取材小鼠耳蜗组织进行RNA-seq分析以及IncRNA-mRNA共表达可视化分析明确隐匿性听力损失的主要调控通路并预测靶基因,然后通过qRT-PCR进一步验证,最后推断Fgf22基因缺陷在噪声诱导的隐匿性听力损失中可能的作用机制;结果:1.Fgf22基因在小鼠外周听觉传导通路中的时空表达特征(1)时间表达特征:Fgf22基因首先在P0时仅在内毛细胞中表达、P7时逐渐出现在外毛细胞中,在P14时在螺旋神经节细胞中也表达,P28的时候表达水平较之前显著增加;(2)空间表达特征:在成年期的小鼠耳蜗中,发现Fgf22基因在内毛细胞、外毛细胞以及螺旋神经节细胞中均存在表达,与时间表达特征相一致;2.通过CRISPR/Cas9技术成功构建Fgf22基因敲除小鼠(1)测序结果显示Fgf22基因敲除成功;(2)与野生型小鼠相比,基因敲除小鼠听力无显著差异;但是在100dB SPL中等程度白噪声暴露2小时作用下,发现Fgf22基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,表现出耳蜗带状突触数量减少、ABRI波幅值下降的特点,差异具有统计学意义;3.成功构建NIHHL动物模型(1)正常C57BL/6J 6周龄成年小鼠在100dB白噪声暴露2小时后,两周后可发现该小鼠表现出暂时性阈移、ABRI波幅值下降、耳蜗带状突触数量显著减少,差异具有统计学意义,可作为NIHHL动物模型;(2)正常C57BL/6J成年小鼠在接受两次100dB白噪声暴露后,两周后发现该小鼠听力检测结果表现出永久性阈移,ABRI波幅值显著下降、耳蜗带状突触数量显著减少,差异具有统计学意义,可作为NIHL动物模型;4.通过RNA-seq明确NIHHL可能的调控通路以及可能的靶基因(1)通过RNA-seq和lncRNA-mRNA可视化共表达分析发现mRNA GNAS和其上游lncRNA Sept7在NE-l st组中表达显著升高,差异具有统计学意义;(2)Adrenergic Signaling通路经过KEGG通路分析发现其p-value值最小,即最有可能成为调控NIHHL疾病发生与发展的信号通路;结论:1.本研究首次发现Fgf22基因在小鼠耳蜗发育过程中,首先在内毛细胞中表达、逐渐出现在外毛细胞中,最后在P28时在螺旋神经节细胞中也存在表达。在成年小鼠耳蜗中,我们发现Fgf22基因在内毛细胞、外毛细胞以及螺旋神经节细胞中均存在表达,与发育表达结果相一致;2.通过CRISPR/Cas9技术成功构建Fgf22基因敲除小鼠,并发现正常情况下与野生型小鼠相比,听力无显著差异,但是在100dB SPL白噪声暴露2小时作用下,Fgf22基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,表现出耳蜗带状突触数量显著减少、ABRI波幅值明显下降的特征;3.正常C57BL/6J成年小鼠在接受一次100dB中等强度白噪声暴露2小时后观察两周,小鼠可表现出暂时性阈移、ABRI波幅值下降、以及耳蜗带状突触数量显著减少,因此可作为隐匿性听力损失动物模型;4.通过RNA-seq和lncRNA-mRNA共表达分析得出结论Fgf22基因很有可能通过Adrenergic Signaling通路调控lncRNA Sept7和mRNA GNAS的表达进而调控隐匿性听力损失的发生与发展。