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目的:探讨吡啶硫酮(Zinc pyrithione, ZPT)联合锌离子对于卵巢癌细胞和顺铂耐药细胞的作用以及机制。
方法:
1.用CCK8实验观察吡啶硫酮锌联合锌离子对卵巢癌细胞SKOV3以及顺铂耐药细胞SKOV3/DDP增殖现象的影响。
2.通过细胞划痕实验、Transwell实验以及用Westernblotting方法检测侵袭迁移相关蛋白MMP2、Vimentin的表达,探究吡啶硫酮锌联合锌离子对于卵巢癌细胞SKOV3以及SKOV3/DDP在侵袭和迁移能力的影响。
3.通过双荧光素酶报告基因检测实验了解吡啶硫酮锌联合锌离子对于SKOV3以及SKOV3/DDP的NF-κB转录活性的影响。
4.用锌离子荧光探针FluoZin-3,AM来探究吡啶硫酮锌联合锌离子时对细胞内锌离子浓度的影响,并且又同时使用溶酶体荧光示踪剂Lysosometracker染色来观察转入的锌离子在细胞器的定位情况。
5.用吖啶橙(AO)荧光染色、免疫荧光染色方法检测cathepsinD在细胞内的再分布情况,观察吡啶硫酮锌联合锌离子对于溶酶体膜完整性的影响。
6.通过AnnexinV-FITC/propidiumiodide(PI)染色以及流式检测细胞的凋亡率,并且通过Westernblotting方法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、pro-和cleaved-caspase-9、pro-和cleaved-caspase-3的表达,探究吡啶硫酮锌联合锌离子对于卵巢癌细胞凋亡的影响。
结果:
1.相比于对照组以及单加吡啶硫酮锌或锌离子组,吡啶硫酮锌联合锌离子能增强对增殖抑制的作用。单用吡啶硫酮锌处理时,在SKOV3以及SKOV3/DDP的半抑制浓度(IC50)分别为0.65μM和0.97μM,但加入锌离子后,吡啶硫酮锌对于两株细胞系的IC50分别降至0.35μM和0.40μM。并且吡啶硫酮锌联合锌离子对增殖抑制效应表现为时间依赖性。
2.吡啶硫酮锌联合锌离子能抑制SKOV3和SKOV3/DDP的侵袭迁移能力。在划痕实验中,观察到联合组的划痕宽度变化较其余组小(P<0.01)。Transwell实验表明联合组较其余组侵袭和迁移的细胞数都少(P<0.01)。检测侵袭迁移相关蛋白发现吡啶硫酮锌联合锌离子能抑制Vimentin以及MMP2的表达,而单加吡啶硫酮锌或者锌离子组与对照组表达几乎无差异(P>0.05)。
3.顺铂耐药细胞SKOV3/DDP相比于SKOV3的NF-κB转录活性明显升高,吡啶硫酮锌可引起NF-κB转录活性升高,锌离子并不会对其活性有明显影响,而吡啶硫酮锌联合锌离子能有效的抑制NF-κB的转录活性。
4.吡啶硫酮锌可作为锌载体快速转运锌离子进入细胞内,并且转入的锌主要定位于溶酶体。用FluoZin-3-AM标记锌离子后,可以发现吡啶硫酮锌联合锌离子组的荧光强度明显高于其他组,并且当同时用溶酶体示踪剂染色时,发现锌离子染色(绿色)基本与溶酶体染色(红色)相重合。
5.转入细胞中的锌离子破坏溶酶体膜的稳定性。在AO染色中,联合组较对照组的红光减弱且绿光增强。在免疫荧光实验发现标记CathepsinD蛋白的绿色荧光减弱。
6.吡啶硫酮锌联合锌离子触发线粒体凋亡反应。在流式结果中发现联合组的凋亡率比其余组都要高(P<0.05),并且联合组还诱发了促凋亡蛋白BAX表达上调、抗凋亡蛋白BCL-2的表达下调以及启动蛋白caspase-9和凋亡执行蛋白caspase-3表达下调,而cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3表达上调(P<0.05)。吡啶硫酮锌或锌离子组的表达水平与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。
结论:吡啶硫酮锌联合锌离子表现出抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭迁移以及NF-κB的转录活性,并触发溶酶体-线粒体凋亡反应。
方法:
1.用CCK8实验观察吡啶硫酮锌联合锌离子对卵巢癌细胞SKOV3以及顺铂耐药细胞SKOV3/DDP增殖现象的影响。
2.通过细胞划痕实验、Transwell实验以及用Westernblotting方法检测侵袭迁移相关蛋白MMP2、Vimentin的表达,探究吡啶硫酮锌联合锌离子对于卵巢癌细胞SKOV3以及SKOV3/DDP在侵袭和迁移能力的影响。
3.通过双荧光素酶报告基因检测实验了解吡啶硫酮锌联合锌离子对于SKOV3以及SKOV3/DDP的NF-κB转录活性的影响。
4.用锌离子荧光探针FluoZin-3,AM来探究吡啶硫酮锌联合锌离子时对细胞内锌离子浓度的影响,并且又同时使用溶酶体荧光示踪剂Lysosometracker染色来观察转入的锌离子在细胞器的定位情况。
5.用吖啶橙(AO)荧光染色、免疫荧光染色方法检测cathepsinD在细胞内的再分布情况,观察吡啶硫酮锌联合锌离子对于溶酶体膜完整性的影响。
6.通过AnnexinV-FITC/propidiumiodide(PI)染色以及流式检测细胞的凋亡率,并且通过Westernblotting方法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、pro-和cleaved-caspase-9、pro-和cleaved-caspase-3的表达,探究吡啶硫酮锌联合锌离子对于卵巢癌细胞凋亡的影响。
结果:
1.相比于对照组以及单加吡啶硫酮锌或锌离子组,吡啶硫酮锌联合锌离子能增强对增殖抑制的作用。单用吡啶硫酮锌处理时,在SKOV3以及SKOV3/DDP的半抑制浓度(IC50)分别为0.65μM和0.97μM,但加入锌离子后,吡啶硫酮锌对于两株细胞系的IC50分别降至0.35μM和0.40μM。并且吡啶硫酮锌联合锌离子对增殖抑制效应表现为时间依赖性。
2.吡啶硫酮锌联合锌离子能抑制SKOV3和SKOV3/DDP的侵袭迁移能力。在划痕实验中,观察到联合组的划痕宽度变化较其余组小(P<0.01)。Transwell实验表明联合组较其余组侵袭和迁移的细胞数都少(P<0.01)。检测侵袭迁移相关蛋白发现吡啶硫酮锌联合锌离子能抑制Vimentin以及MMP2的表达,而单加吡啶硫酮锌或者锌离子组与对照组表达几乎无差异(P>0.05)。
3.顺铂耐药细胞SKOV3/DDP相比于SKOV3的NF-κB转录活性明显升高,吡啶硫酮锌可引起NF-κB转录活性升高,锌离子并不会对其活性有明显影响,而吡啶硫酮锌联合锌离子能有效的抑制NF-κB的转录活性。
4.吡啶硫酮锌可作为锌载体快速转运锌离子进入细胞内,并且转入的锌主要定位于溶酶体。用FluoZin-3-AM标记锌离子后,可以发现吡啶硫酮锌联合锌离子组的荧光强度明显高于其他组,并且当同时用溶酶体示踪剂染色时,发现锌离子染色(绿色)基本与溶酶体染色(红色)相重合。
5.转入细胞中的锌离子破坏溶酶体膜的稳定性。在AO染色中,联合组较对照组的红光减弱且绿光增强。在免疫荧光实验发现标记CathepsinD蛋白的绿色荧光减弱。
6.吡啶硫酮锌联合锌离子触发线粒体凋亡反应。在流式结果中发现联合组的凋亡率比其余组都要高(P<0.05),并且联合组还诱发了促凋亡蛋白BAX表达上调、抗凋亡蛋白BCL-2的表达下调以及启动蛋白caspase-9和凋亡执行蛋白caspase-3表达下调,而cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3表达上调(P<0.05)。吡啶硫酮锌或锌离子组的表达水平与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。
结论:吡啶硫酮锌联合锌离子表现出抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭迁移以及NF-κB的转录活性,并触发溶酶体-线粒体凋亡反应。