神经干细胞(neural stem cell,NSCs)是指具有分化为神经元和神经胶质细胞的能力,能够自我更新,并提供大量神经细胞的原始细胞群。近年来,有关NSCs的研究已成为神经生物学领域的研究热点,因为它既是研究神经系统发育和神经细胞分化的良好载体,又是治疗中枢神经系统(central nervous system,CNS)损伤以及退行性疾病最理想的供体细胞来源之一。目前,原位诱导内源性NSCs增殖分化或NSCs移植已被尝试用于治疗帕金森症、亨廷顿病、癫痫、脑缺血和中枢创伤等多种中枢神经系统疾病。研究表明,内源性NSCs激活或外源性NSCs移植可以明显缓解疾病的临床症状,并在一定程度上促进受损功能的恢复。 NSCs定向诱导分化为成熟的具有功能的神经元或胶质细胞是使其能应用于临床治疗的关键问题。研究发现,NSCs的分化与其所处微环境密切相关。微环境主要由各种可溶性因子、膜结合因子和细胞外基质(ECM)等众多复杂的成分所构成,这些成分相互影响,相互协调,通过细胞间相互作用的方式参与NSCs的分化发育和功能调节。因此,深入的研究微环境对NSCs分化的调节作用,对临床治疗神经系统疾病具有重要意义。 近年来,嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植被认为是脊髓损伤最有前景的治疗方法之一。动物实验发现,OECs移植可以促进大鼠皮质脊髓束再生,并促进肢体运动功能恢复。临床实验也显示,人OECs种植于脊髓损伤患者的脊髓中,可以部分改善脊髓功能。研究发现,移植的OECs可以通过多种机制促进神经再生。移植的OECs通过分泌多种细胞黏附分子和神经营养因子,使脱髓鞘的轴突重新生成髓鞘,为轴突的再生提供一个良好的微环境；同时形成一个化学和物理屏障来防止再生轴突与胶质瘢痕中的抑制因子接触,进而促进脊髓损伤修复。然而,移植OECs对中枢内源性NSCs增殖和分化是否具有影响目前还知之甚少。 本实验旨在研究OECs对NSCs分化的影响及其可能的作用机制,为研究OECs在CNS损伤修复中的生物学机制提供新的线索,同时也为NSCs移植用于神经系统退行性疾病及CNS损伤的临床治疗提供一些新的思路。 在研究中,我们首先从成年新生(24小时内)GFP转基因小鼠大脑皮质区分离培养,鉴定NSCs,然后采用细胞共培养模型,比较OECs,大脑皮层混合细胞(CTX),神经胶质瘤细胞株(B104 neuroblatoma cells,B104 cells)对NSCs分化的影响,通过观察细胞形态,统计分析不同条件下NSCs分化为NG2阳性细胞和GFAP阳性细胞的比例,从而对OECs诱导NSCs分化的影响进行初步的探索。结果发现： (1)在含有神经营养因子bFGF的生长培养液中,来自新生GFP转基因小鼠大脑皮层的NSCs迅速分裂增殖,形成悬浮生长的细胞球。神经球免疫荧光染色显示,神经球中几乎所有细胞都表达NSCs的特异性标志Nestin。在撤离神经营养因子,并添加N2的条件下,生长在Poly-L-Lysine包被的coverslip上的NSCs可以分化为Tujl阳性的神经元、GFAP阳性的星形胶质细胞以及NG2阳性的细胞。 (2)在细胞共培养模型中,将NSCs与OECs、CTX以及B104共培养,在无血清N2培养基诱导分化7天后,观察发现OECs组中,NG2染色阳性细胞比例明显低于三个对照组,具有显著的统计学差异。 (3)进一步采用OECs条件培养液(conditioned medium,CM)和固定细胞共培养(fixed cell co-culture,Fix)实验,发现在无血清培养基N2诱导分化7天后,CM组和固定的OECs与NSCs共培养组中,NG2染色阳性细胞比例均明显低于对照组,具有显著的统计学意义。 (4)在细胞共培养模型中,将NSCs与OECs、CTX以及B104共培养,在无血清N2培养基诱导分化7天后,观察发现OECs组中,GFAP染色阳性细胞比例明显高于对照组,具有显著统计学差异。 (5)进一步采用OECs条件培养液(conditioned medium,CM)和固定细胞共培养(fixed cell co-culture,Fix)实验,在无血清培养基N2诱导分化7天后,观察发现在共培养组中,GFAP染色阳性细胞比例明显高于对照组,具有显著统计学差异。而在CM组和Fix cell co-culture组中,GFAP染色阳性细胞比例与对照组相比无统计学意义。 本实验结论如下： (1)原代培养新生GFP转基因小鼠神经干细胞球在体外增殖迅速,Nestin染色阳性,在无血清N2培养基诱导7天后,其分化为神经元,星形胶质细胞,NG2阳性细胞,符合NSCs基本生物学特征,在本实验中成功建立了GFP转基因小鼠大脑皮层NSCs体外原代培养的技术。 (2)OECs抑制NSCs向NG2阳性细胞分化,此作用由OECs细胞表面分子和OECs分泌的可溶性分子参与介导。 (3)OECs促进NSCs向星形胶质细胞方向分化,单独的OECs细胞表面分子或OECs分泌的可溶性分子无此作用,说明OECs对NSCs向星形胶质细胞方向分化的影响可能需要OECs细胞表面分子或OECs分泌的可溶性分子的协同作用。