【摘 要】
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背景:急性肝衰竭（Acute liver failure,ALF）是一种急速进展的炎症性疾病,病情凶险,死亡率高,目前尚无有效防治方法。因此,探寻防治ALF的新策略具有重要临床意义。以乙酰化修饰为重要标志的表观遗传对基因转录如何响应细胞内外环境变化具有重要调控作用,乙酰化修饰可直接调控炎症相关基因表达,提示其可能是决定ALF疾病进展速度的一种关键机制。冬凌草甲素（oridonin）是从中药冬凌草中
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（81570549,81070344）；
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背景:急性肝衰竭（Acute liver failure,ALF）是一种急速进展的炎症性疾病,病情凶险,死亡率高,目前尚无有效防治方法。因此,探寻防治ALF的新策略具有重要临床意义。以乙酰化修饰为重要标志的表观遗传对基因转录如何响应细胞内外环境变化具有重要调控作用,乙酰化修饰可直接调控炎症相关基因表达,提示其可能是决定ALF疾病进展速度的一种关键机制。冬凌草甲素（oridonin）是从中药冬凌草中分离的活性双萜类化合物,具有广泛的抗炎活性。由此,我们提出oridonin可通过调控乙酰化酶活性,由此阻抑肝组织炎症及其介导的肝细胞凋亡来防治ALF的假说。目的:（1）探讨oridonin在体内外是否具有乙酰化酶抑制剂活性;（2）探讨oriodnin是否对LPS/D-Gal诱导的小鼠ALF具有保护作用;（3）探讨oridonin防治小鼠ALF的分子机制。方法:（1）以oridonin分别预处理小鼠肝星状细胞（HSC）系JS-1和LPS/D-Gal小鼠ALF模型,分别抽提JS-1细胞和实验小鼠ALF肝组织总蛋白,检测细胞及肝组织中组蛋白及α-tublin乙酰化水平变化。（2）腹腔注射LPS/D-Gal建立小鼠ALF模型。实验动物分为正常对照组（a）、模型组（b）、oridonin干预组（c:建模前1h腹腔给药;d:建模前每4天给药一次,共3次,最后一次于建模前1h腹腔给药）、药物对照组（e）。每组35只小鼠,于LPS/D-Gal诱导6h每组处死5只小鼠,各组余30只饲养至48h,观察小鼠生存率。以HE染色评估肝组织病理学变化,以全自动血生化仪检测血清ALT、AST水平,以末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测肝细胞凋亡;以免疫印迹法检测凋亡相关蛋白变化。（3）提取肝组织RNA行转录组测序（RNA-SEQ）,筛选差异表达基因,寻找oridonin可能作用的靶点;Real-time PCR验证炎症、免疫及趋化相关细胞因子m RNA表达;以MPO试剂盒检测小鼠ALF肝组织MPO活性;免疫印迹法检测调控炎症信号通路关键蛋白表达。结果:（1）Oridonin可显著抑制由TSA处理诱导的组蛋白及α-tublin乙酰化水平增加;oridonin预处理后可呈剂量依赖性抑制ALF小鼠肝组织蛋白总泛乙酰化水平,以H3、H4及α-tublin乙酰化水平降低最明显。（2）Oridonin可明显改善LPS/D-Gal诱导小鼠ALF的肝组织学及生化学,显著降低ALF小鼠48h死亡率。TUNEL染色显示oridonin可显著抑制LPS/D-Gal诱导的ALF小鼠肝细胞凋亡（P＜0.05）,并伴促凋亡因子TNF-α下调、JNK依赖线粒体凋亡通路促凋亡蛋白下调及抗凋亡蛋白bcl-2上调（P＜0.05）。（3）转录组测序分析显示,在小鼠ALF疾病进展期间,oridonin预处理可下调由LPS/D-Gal诱导上调的278个基因;GO功能聚类分析显示上述差异表达基因主要富集于炎症、免疫及趋化反应中;KEGG pathway分析显示上述差异表达基因主要富集于TLR4及NOD样受体等信号通路;Real-time PCR证实oridonin可呈剂量依赖性抑制LPS/D-Gal诱导的炎症、免疫及趋化等细胞因子表达上调（P＜0.01）;oridonin可显著抑制LPS/D-Gal诱导的ALF小鼠肝组织MPO活性（P＜0.01）;免疫印迹法证实oridonin可剂量依赖性下调由LPS/G-Gal诱导的ALF小鼠肝组织P-IRAK4(Thr345/Ser346),Ac-IRAK4(Lys34),P-JNK、P-ERK、P-P38及P-IκB表达上调（P＜0.05）。结论:（1）Oridonin在体内外均显示明显的乙酰化酶抑制剂活性。（2）Oridonin对LPS/D-Gal诱导的小鼠ALF具有显著保护作用;该保护效应可能（部分）与其抑制小鼠ALF肝组织炎症及其介导的肝细胞凋亡有关。（3）抑制IRAK4(Ser345/Thr346)磷酸化及IRAK4(lys34)乙酰化,由此削弱IRAK4与My D88结合并降低其激酶活性可能是oridonin发挥抗炎及抗凋亡作用的分子机制。研究结果提示oridonin在ALF临床干预方面可能具有潜在应用前景。
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