背景和目的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,据WHO于2005年的统计,全世界每年新增肝癌患者62万,每年约59万人死于肝癌,在我国每年有20~30万人死于肝癌[1],严重威胁我国人民的生命健康,因而一直是我国研究的重点肿瘤之一。HCC之所以目前治疗效果仍不尽如人意,其中很重要的原因之一是我们至今仍不知道人体早期小HCC具有何种分子生物学特征;对早期相对良性小HCC向晚期恶性状态演变的分子机制的认识尚属空白,此种状况也导致了目前对小HCC概念的混乱。目前依据HCC瘤体大小设定的标准有5cm,4.5cm,4cm,3.5cm,3cm,2.5cm不等,缺乏分子生物学意义上的理论依据,这种状况严重影响了临床对早期小HCC诊断与治疗水平的提高,成为制约肝脏外科进一步发展的瓶颈之一,临床上迫切需要小HCC的新理论和新概念用于指导医疗实践。现代肿瘤分子生物学研究表明,肿瘤是一种基因病,是由多基因变异并长期累积所致[2, 3]。单个基因的变异并不足以完成从正常细胞恶性转化→癌前病变→早期肿瘤→晚期肿瘤的整个复杂过程,而需要一组肿瘤相关基因的连续动态变异才可以完成。显然,从基因组不稳定性的角度探讨早期HCC形成与演进的分子机制,有可能成为认识早期小HCC病理生物学特性演变规律的重要突破口。根据以上分析,本研究设计了对HCC癌前病变——异型增生结节(dysplastic nodule,DN)、微小HCC(Micro HCC,d<1cm)、小HCC(small HCC,d<3cm)和大HCC(large HCC,d>3cm)4组病变以及肝脏良性肿瘤肝细胞腺瘤(hepatocellular adenoma,HCA)进行覆盖6条染色体的64个微卫星标志物的基因组不稳定性检测,旨在详细探讨早期HCC的分子生物学特性,并寻找具有临床实际应用价值的早期小HCC的微卫星诊断谱系。方法采用PCR-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色技术,对199例HCC中40个微卫星多态性标记物的2种变异特征——杂合子缺失(loss of heterozygosity,LOH)和微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)进行检测;应用毛细管电泳测序技术对49例HCC、10例HCA和8例DN进行了五条染色体臂24个位点的微卫星变异检测。各位点基因组不稳定情况与临床病理学特点的关系用卡方检验或Fisher确切概率法进行检验,各组病变片段等位基因缺失(FAL)值比较用t-test,P<0.05为有统计学意义。结果应用微卫星多态性标记的研究显示,199例HCC在一个或多个基因座发生LOH的总频率为96.4% (185/192),总体上看,与血清AFP、HBsAg、肿瘤大小、Edmondson分级、包膜完整与否、癌栓情况和组织学类型等临床病理学参数的关系无统计学意义;MSI的发生率为61.8% (123/199)。染色体1p、4q、8p、16q、和17p的LOH发生频率分别为62.1%(113/182),63.4%(111/175),71.1%(135/190),53.5%(84/157),41.5%(39/94)。高频LOH(≥30%)的基因座为:1号染色体上的D1S507(30.2%);4号染色体上的D4S415(51.1%)、D4S1538(42.9%)、D4S406(35.7%)和D4S426(35.5%);8号染色体上的D8S520(36.4%)、D8S264(35.6%)、D8S277(34.7%)和D8S261(32.3%);16号染色体上的D16S515(46.6%)。D1S199, D1S234, D1S434, D1S507 , D1S2893, RIZ, D4S406, D4S1615, D8S277, D8S1721, D8S1733, D16S408, D16S498, D16S507, D16S512, D17S261, D17S849, D17S921, D17S799, D17S926和D17S786基因座,肿瘤直径<1cm或<2cm组的LOH率明显高于>1cm或>2cm组(P<0.05或P<0.01);D1S199和D4S406基因座,包膜完整者的LOH显著高于包膜突破者(P<0.05),D1S468和D17S849基因座包膜突破者LOH显著高于包膜完整者(P<0.05);D1S243,D1S468,D8S1706和D16S512基因座包膜外癌栓者LOH显著高于无或包膜内癌栓者(P<0.05);D1S468基因座肿瘤Edmondson分级3,4级组的LOH频率显著高于1,2级组(P=0.008),在D4S415基因座, Edmondson 1、2级组的LOH率明显高于Edmondson3、4级者(P=0.01);D1S434,D8S277,D16S3091和D17S926基因座,肿瘤组织学类型细梁型的LOH显著高于粗梁型者(P<0.05),而D1S468和D8S1771基因座粗梁型的LOH明显高于细梁型者(P<0.05);D8S520基因座,血清HBsAg阴性患者的LOH频率显著高于HBsAg阳性者(P=0.043);在D8S1771基因座,背景病变无肝硬化组的LOH显著高于有肝硬化组(P=0.029),D4S415,D8S1733,D17S799,D17S849和D17S926基因座,背景病变有肝硬化组的LOH显著高于无肝硬化组(P<0.05或P<0.01);RIZ,D8S549和D17S520基因座,女性患者的LOH显著高于男性患者(P<0.05),D4S415和D16S512基因座,男性患者的LOH显著高于女性患者(P<0.05)。对比研究HCA、DN和HCC的研究发现,染色体臂8p、9p和17p在HCA、DN和HCC中的LOH频率呈现递增趋势,4q、9p和17p染色体DN组和HCC组LOH频率的差别有统计学意义(P=0.048,P=0.001,P<0.001),HCC组高于DN组。5条染色体臂上HCC中高频LOH位点(≥50%)包括:D4S415(55.6%,20/36),D17S1791(66.7%,16/24),D17S720 (61.8%,21/34),D17S1796 (60.0%,9/15),D17S786 (56.7%,17/30),D17S520 (55.2%,16/29),D17S960 (55.0%,11/20),D9S916(62.5%,10/16),D9S1751 (52.4%,11/21)和D9S161 (50.0%,9/18);DN中发生LOH的位点包括:D17S1796(80.0%,4/5),D17S720(25%,2/8),D17S786 (14.3%,1/7),D17S960 (20%,1/5),D17S1791(20%,1/5),D17S1856(20%,1/5),D17S1881(12.5%,1/8),D8S1721(28.6%,2/7),D9S916(50%,3/6),D9S1751(25%,1/4)和D9S1749(22.2%,2/9)。HCA中发生LOH的位点包括:D17S720(12.5%,1/8),D17S921(28.6%,2/7),D17S1791(12.5%,1/8),D17S1796 (33.3%,2/6),D17S1881(28.6%,2/7),D4S415(12.5%,1/8),D8S1721(14.3%,1/7),D1S507 (10.0%,1/10),D9S916(33.3%,1/3),D9S1751(20.0%,1/5)和D9S1749(10.0%,1/10)。HCC中LOH频率显著高于DN的位点为D17S520(P=0.011);D17S1796位点DN组LOH频率高于HCC。发生于同一个体的四组病例中,病例1、3、4分别有2、4、6个位点HGDN和HCC表现为相同类型的微卫星变异。DN、Micro HCC、small HCCFAL值呈现递增趋势;HCC组FAL值显著高于DN组及HCA组(PDN<0.001, PHCA<0.001)。HCC组FAL值与Edmondson分级和背景病变肝硬化状态有关,Edmondson3, 4级FAL值高于1, 2级组;背景病变无肝硬化组FAL值高于背景病变有肝硬化组,P值分别为0.035和0.031。结论HCC存在广泛的微卫星变异,一些基因座如D1S507,D4S415,D4S1538, D4S406,D4S426,D8S520,D8S264,D8S277,D8S261和D16S515发生高频LOH。其中以代表肿瘤抑制基因路径的LOH方式在HCC的发生和发展过程中起主要作用,代表错配修复基因路径的MSI的作用次之。在一些特定染色体区的等位基因缺失与HBV感染、血清AFP水平、肿瘤大小、肝硬化、Edmondson分级、肿瘤包膜突破等相关。HCA、DN在部分位点发生LOH,与HCC有重叠,提示在正常细胞转化为病变的过程可能有部分共同的遗传通路。此外,DN和HCC有共同的克隆起源。FAL值在从DN到MicroHCC再到small HCC过程中呈现递增趋势。HCC的Edmondson分级及背景病变有无肝硬化与FAL值显著相关。