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多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)是一种有荚膜的革兰氏阴性杆菌,能引起牛、猪、兔和鸡等畜禽甚至人类发生以出血性败血症或呼吸系统疾患为主要特征的疾病。该菌广泛分布于世界各地,在同种或不同种动物间可引起相互感染。Carter根据菌体荚膜抗原的不同,将其分为A、B、D、E和F五个荚膜血清型,其中对牛具有致病性的主要是荚膜血清A型、B型或E型。以往在牛群中流行的主要是以引起出血性败血症为主的荚膜血清B型,但近年来在牛群中发现的主要是以引起肺部感染为主的荚膜血清A型。目前,牛呼吸系统疾病已对养牛业造成重大威胁,该病常于牛群引进7-10d后发病,临床症状以呼吸困难、干咳、鼻孔流泡沫性脓性液体及腹泻为主要特征；发病率高达50%-100%,病死率10%-50%。自2008年我国报道从发病牛群中分离鉴定到A型P. multocida以来,因该病原引起的疾病在我国多个省市均有发生,给养牛业造成了重大经济损失。细菌的毒力因子,对细菌的致病性以及在感染宿主体内的存活与繁殖能力都有重要作用。大多毒力因子具有较强的免疫原性,对这类毒力因子进行研究将为巴氏杆菌病的防制奠定重要的理论基础。本研究从众多因子中选择了7个主要毒力因子：外膜蛋白A(OmpA)、外膜蛋白H(OmpH)、丝状血球凝集素蛋白(FhaB)、外膜脂蛋白E (PlpE)、血红素获得受体(HasR)、以及两个功能未明确的毒力因子PM0979和PM0442,以本室分离鉴定的6株毒力不一的牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌为研究对象,先后从毒力相关基因的核苷酸序列以及基因转录水平进行分析,试图探讨造成P. multocida毒力差异的关键基因。主要研究内容和结果如下：1.6株牛源荚膜血清A型P. multocida毒力相关基因的克隆及序列分析以6株毒力大小不一的牛源荚膜血清A型P. multocida (CQ1、 CQ2、CQ3、 CQ4、CQ5、CQ6)基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增7个毒力相关基因(ompA、 ompH、pfhB2、 plpE, hasR、pm0979、pm0442),然后分别将其克隆至pMD19-T载体上,经序列测定,分析6株菌间不同毒力相关基因的差异,并分别构建进化树,确定遗传进化距离。结果表明,7个毒力相关基因在6株菌间有较高的保守性,其核苷酸序列同源性大于94.7%,氨基酸序列同源性大于87.9%,结果提示导致6株菌毒力不一的原因可能是由于基因的表达丰度以及表达调控不同而造成,也可能有其它更多毒力基因参与作用。2. P. multocida毒力相关基因SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立参照GenBank中已登录的多杀性巴氏杆菌ompA、ompH、pfhB2、plpE、hasR、pmm0979和pm0442基因序列以及管家基因16S rRNA基因序列,选择了各个基因的保守区,基于严格的引物设计原则,应用Oligo7.0设计了各个基因的特异性引物。通过温度梯度实验以及标准曲线的建立,优化并确定了各个毒力基因QRT-PCR的最佳退火温度及反应性能,包括线性的标准曲线、高扩增效率以及一致的重复反应。结果表明,ompA、ompH、pfhB2、plpE、hasR、pm0979和pm0442基因的最佳退火温度分别为57℃、55.7。C、57℃、60.1℃、64.5℃、64.5℃、59℃；管家基因16S rRNA的最佳退火温度为55.7℃；所有基因的扩增效率E在90.8%-97.2%之间,可行度R2在0.994-1.000之间,且绝大多数在0.998-1.000的范围内,重复性好,为后续研究奠定了良好的方法基础。3.两株牛源荚膜血清A型P. multocida毒力相关基因体内外表达差异的研究以本室分离培养的两株毒力迥异的牛源荚膜血清A型PmCQ2(毒力较强)和PmCQ6(毒力较弱)为对象,从转录水平研究7个毒力相关基因(ompA、ompH、 pfhB2、plpE、hasR、pm0979和pm0442)在小鼠体内主要脏器(肝、肺、脾和肾等)的相对表达差异以及动态分布情况,同时结合其体外表达水平进行分析。结果表明：(1)在体外培养条件下,PmCQ6各毒力相关基因表达水平均明显高于PmCQ2;但在体内恰恰相反,在各主要脏器PmCQ2大多数毒力相关基因表达水平均明显高于PmCQ6(hasR基因例外,肝脏中hasR基因的表达PmCQ6明显强于PmCQ2),结果提示可能是由于体内外生存环境的不同导致这些基因的表达调控发生了改变,同时暗示hasR基因可能对毒力的影响不大。(2)从单个基因在脏器的表达分布来看,PmCQ2和PmCQ6在肝、脾和肾脏中各基因普遍都有大量表达,在肺脏中相对较少,但PmCQ2的pm0442, pm0979基因例外,它们在肺脏中存在大量表达。P. multocida主要引起机体肺部感染与病变,因此,我们猜测这两个基因可能起着比较关键的作用。(3)基因pm0442表现尤为突出。不论是PmCQ2或PmCQ6, pm0442基因在体外培养条件下表达水平都比ompA和ompH低很多,但在体内表达情况却完全相反,同时在肺脏中PmCQ2的pm0442基因表达水平又明显高于PmCQ6,暗示在体内条件下pm0442基因可能对毒力起关键性作用。研究结果为牛源荚膜血清A型P. multocida毒力相关基因和致病机制的深入探讨奠定了基础。