我国是病毒性肝炎的高发区,尤其是在农村及经济不发达地区,其发病率高达10-15%,由病毒性肝炎导致的重型肝炎或肝衰竭,其死亡率高达50-70%或更高,由慢性肝炎引起的肝纤维化或肝硬化,严重影响了患者的生存质量。肝纤维化进一步可发展至肝硬化,甚或终末期肝病阶段,发展至终末期肝病则缺乏广泛可行的有效治疗手段,尽管肝移植可作为治疗肝衰竭和肝硬化失代偿期的有效手段,但肝移植存在费用昂贵,手术复杂,术后可能发生严重的排斥反应,生存率不高等缺点,尤其是供体肝缺乏,使得这一治疗措施难以广泛推广。骨髓间充质干细胞(MSCs)是一群具有多向分化潜能的干细胞,在特定的诱导条件下,可以分化为多种造血以外的组织,如成骨细胞、神经元细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、心肌细胞、肝细胞等。MSCs来源广泛,取材容易,便于自体移植,且在体外长期培养过程中,MSCs始终保持其多向分化的潜能,遗传背景相当稳定,体外基因转染率高,并能稳定高效地表达外源基因,故体内植入反应弱,是一种理想的组织工程种子细胞,具有治疗急慢性肝衰竭的潜能。因此,MSCs向肝系细胞的定向分化已受到学者们的广泛关注。1理论研究现代医学对MSCs了诱导分化为肝细胞的研究取得了一定的进展,但是单纯的MSCs进行在体移植,进入体内很容易被扩散或蛋白酶水解,能达到坏死肝细胞的MSCs不多,其肝细胞的分化率不仅很低,实际应用前景有限;而体外诱导分化则是在化学制剂的条件下实现,其肝细胞的分化率也很低,而且其临床安全性和长期有效性还难以实现。因此,如何促进MSCs向肝细胞完全意义上的转化,以便更有效改善病变肝组织的结构和功能将成为未来相关研究的重中之重。中药对MSCs诱导作用的研究起步较晚,近年来,不少研究机构证明中药对MSCs的定向分化有调控作用,并且有比传统的西医学方法高的诱导率。已有学者成功运用中药有效成分诱导MSCs分化为神经细胞、心肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞等,目前国内外还没有关于应用中药单体有效成分诱导MSCs分化为肝细胞的研究报道,我们在众多的中药中,选用临床上较常用的治疗肝病的名贵中药冬虫夏草的有效成分虫草多糖来进行研究。现代中药药理研究表明,虫草多糖对肝细胞的损害及肝纤维化有较好的保护作用。而MSCs具有多种多分化潜能,根据既往利用中药有效成分诱导MSCs定向分化的研究成果,理论上相信虫草多糖在适当的条件下可以诱导MSCs分化为肝细胞,研究探索中药诱导MSCs分化为肝细胞,不仅将为应用中医药治疗急性肝衰竭提供新的理论依据,而且由于中药固有的安全性和长期有效性,可以克服目前现代医学研究中存在的某些困境,因此有可能与细胞移植治疗急性肝衰竭、肝硬化失代偿期的方法结合,带来广阔的应用前景,所以积极开展中药诱导MSCs分化为肝细胞的研究有重要意义。随着中医药的临床实践的不断深入,人们从中药中发现了可以治疗肝纤维的有效药物及其组分或成分,经过临床及实验得到了验证,显示中医药在抗肝纤维化治疗中的优势及潜力。冬虫夏草是我国传统滋补中药,有“保肺,益肾,补精髓,止血化痰,已劳咳,治膈症皆良”之功效,现代研究发现了其具有多种药理作用,拓展了其应用范围,已有体外实验表明虫草制剂可减轻实验型肝纤维化大鼠模型的肝纤维化指标,保护肝细胞,本研究使用虫草菌丝制剂(百令胶囊)来治疗乙肝后肝纤维化患者,观察其临床疗效,并初步探讨虫草制剂治疗肝纤维化的机制,为临床应用提供更多的科学依据。2实验研究2.1实验一虫草多糖体外诱导大鼠MSCs分化为肝细胞的研究目的:探讨虫草多糖能否体外诱导大鼠MSCs分化为肝细胞及其方法条件。方法:取成年Wister大鼠骨髓,采用贴壁法进行培养,流式细胞仪法检测细胞表面抗原CD34和CD44。对MSCs分组进行诱导,虫草组:用虫草多糖进行诱导,终末浓度为0.15mg/ml;阳性对照组:肝细胞生长因子(HGF)和表皮生长因子(EGF)联合诱导,浓度分别为20ng/ml和10ng/ml;空白对照组仅用基本培养基。倒置显微镜下连续观察细胞形态变化及增殖情况。于培养的7天、14天、21天、28天以免疫组化法检测肝细胞特异性标记AFP、CK18、ALB的表达,PAS法进行糖原染色。结果:原代培养的MSCs 24h小时后部分细胞贴壁,48h时大部分细胞贴壁,一周后细胞体积增大,多见长梭形、多角形细胞。细胞增殖明显增快,9天左右铺满瓶壁,胰酶消化传代后细胞形态多为梭形,较前均匀,部分多角形,增殖更快,成集落式生长,一般7天可铺满瓶壁90%。连续传代,P4代后,细胞形态变化不大。分离纯化的P3代MSCs检测CD34为阴性表达,CD44为阳性。对诱导分化后的细胞行免疫组化鉴定:虫草组及阳性对照组7天时出现AFP表达,14天时表达增强,28天时表达减弱;CK18阳性对照组7天时出现表达,14天时表达增强。虫草组则14天时出现表达,而后持续。ALB 7天时两组表达阴性,14天时出现阳性;对照组的AFP阳性率高于虫草组。糖原染色两组14天时出现阳性结果,28天时表达减弱。空白组结果皆为阴性。结论:虫草多糖可以体外诱导大鼠MSCs分化为类肝细胞。2.2实验二:百令胶囊治疗肝炎后肝纤维化临床疗效观察目的:探索治疗肝纤维化的有效药物。观察虫草菌丝制剂(百令胶囊)对慢性乙肝、早期肝硬化患者肝纤维化的疗效。方法:选择广州中医药大学及广东省中医院2008年1月-2008年12月份住院及门诊治疗后长期随访的慢性活动性肝炎及早期肝硬化患者36例。随机分为对照组和治疗组,两组各18例,全部组别给予肝泰乐0.2g,3次/日、维生素C2.0,口服,3次/日,甘利欣150mg+GS 250ml静滴2周,后改为甘草酸二胺胶囊,2粒,口服,3次/日等基础护肝药物。治疗组在对照组基础上给予百令胶囊(虫草菌丝体干粉,中美浙江华东制药有限公司生产)0.2g/粒,4粒/次,3次/天,口服。观察患者症状改善及血清生化学指标情况,3个月为一疗程。一个疗程后,评定疗效。结果:从临床疗效看,治疗组显效5例,有效11例,无效2例,总有效率为89%;对照组显效2例,有效10例,无效6例,总有效率为67%,两组总有效率比较有统计学意义(P＜0.05),治疗组的疗效优于对照组。两组治疗后,患者症状皆有改善,但治疗组的改善更为显著,与治疗前对比,差异有显著性(P＜0.05);对照组与治疗前相比差异无统计学意义。在肝功能检测方面两组自身治疗前后比较都有显著性差异(P＜0.05),治疗后两组肝功指标比较差异无统计学意义(P＞0.05)。两组治疗后,肝纤维化指标HA、PCⅢ、LN、Ⅳ-C皆有所改善,组内前后对比有显著差异(P＜0.05);治疗组的效果更为优异,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结论:百令胶囊(虫草菌丝体干粉)可有效治疗肝纤维化及早期肝硬化,保护肝细胞,改善患者的肝功能及HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C血清学指标。