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紫杉醇是一种作用较强的化疗制剂,可与细胞内纺锤体微管结合,抑制微管的组装,破坏纺锤体微管聚合解聚的动态平衡,从而导致有丝分裂阻滞及细胞死亡。目前常用于乳腺癌和卵巢癌等实体瘤的治疗,但是其作用常因药物耐受的形成而受到限制[1]。临床上多认为宫颈癌对化疗不敏感,因此化疗仅用于宫颈癌复发及晚期不能手术患者的姑息治疗。故对紫杉醇耐药原因进行探讨、提高其敏感性是当今医疗界亟待解决的问题之一。目前对紫杉醇作用的机制尚不完全清楚,研究发现紫杉醇主要通过影响分裂期细胞起作用;细胞分裂是一个复杂的过程,受多种基因和蛋白质调控,所以探索影响细胞分裂的蛋白质与紫杉醇之间的关系,可能对研究其耐药机制有着重要的意义。CENP-E(centromere protein E)是一种特异地作用于有丝分裂期的驱动蛋白,连接着丝粒与纺锤体微管,在细胞分裂过程中具有重要的作用:不仅在染色体运动及中板集合中起着重要作用;而且还可能是有丝分裂检查点信号途径的一个关键蛋白[2];通过各种方法如显微注射抗体,siRNA,反义寡核苷酸或表达显性负相突变体等破坏CENP-E的功能,均能使中期出现错排的染色体[3、4、5]。CENP-E也是目前研究发现的最有潜力的抗有丝分裂药物靶点[29];CENP-E mRNA在大部分肿瘤组织中的表达相对于癌旁组织都是过表达[6]。本研究拟通过抑制肿瘤细胞CENP-E表达和紫杉醇处理肿瘤细胞的双重作用,探索CENP-E表达与肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性的关系。本研究利用RNAi技术下调Hela细胞中CENP-E的表达,通过MTT和FCM法观察低表达CENP-E的Hela细胞对紫杉醇的敏感性,从而探讨CENP-E与紫杉醇在抗肿瘤治疗中的相关性。结果显示下调CENP-E的表达能增强宫颈癌细胞对紫杉醇的敏感性。并构建针对CENP-E的腺病毒载体,为进一步验证CENP-E在体内对紫杉醇敏感性的影响提供有效的工具。第一部分RNA干扰技术抑制内源性CENP-E基因在宫颈癌细胞中的表达目的:重组表达干扰质粒载体转染宫颈癌细胞(Hela)后,观察CENP-E基因表达的变化;以及CENP-E基因下调对有丝分裂检查点的影响。方法:pshRNA-CENP-E重组质粒转染人宫颈癌Hela细胞,转染48h后运用荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹(Western blot)及间接免疫荧光方法评价CENP-E的mRNA水平、蛋白水平以及内源性表达变化。CENP-E干扰后用微管解聚剂Nocadazol处理16h,观察细胞周期的变化。结果:pshRNA-CENP-E可有效的抑制CENP-E的mRNA水平,蛋白水平以及内源性表达。CENP-E下调后的细胞用Nocadazol处理,G2/M期细胞显著降低。结论:pshRNA-CENP-E能够特异地抑制CENP-E的表达,为后续实验提供基础;CENP-E基因下调后,减弱了Nocadazol有丝分裂检查点依赖的细胞周期抑制,有丝分裂检查点的功能可能受到一定的损伤。第二部分CENP-E基因下调对紫杉醇作用于宫颈癌细胞敏感性的分析目的:探讨CENP-E基因与紫杉醇协同作用下对肿瘤细胞的影响。方法:本实验将细胞分为三组,分别为:未转染组(即空白对照组,Hela),转染pGenesil-1质粒空载组(即实验对照组,Hela/ pGenesil-1) ,以及转染pshRNA-CENP-E质粒组(即实验组,Hela/pshRNA-CENP-E),用不同浓度(1,3,10,30,100,300,1000,3000nmol/L)的紫杉醇处理,用MTT(四唑盐比色试验)检测细胞增殖情况,FCM(流式细胞仪)检测细胞凋亡。结果:MTT结果显示,CENP-E下调的细胞在不同浓度下的增殖抑制率与对照组相比明显增加(P﹤0.05),并呈现剂量依赖性;流式结果显示下调CENP-E,细胞的凋亡率明显增加(P﹤0.05)。结论:下调CENP-E的表达能增强宫颈癌细胞对紫杉醇的敏感性。第三部分针对CENP-E基因构建的siRNA腺病毒载体目的:为验证体内试验,构建针对着丝粒蛋白CENP-E的siRNA腺病毒载体。方法:设计并合成针对CENP-E的siRNA的靶序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS中,与腺病毒骨架质粒pAdeasy -1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染HEK293细胞,包装得到含siRNA-CENP-E的重组腺病毒,并进行大量扩增。结果:构建的穿梭质粒经测序测定,与设计的干扰质粒完全符合。重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后可见一条4.5Kb和约30Kb的条带,表明同源重组成功。将线性化的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后于荧光显微镜下可见红色荧光。结论:成功构建CENP-E的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究CENP-E的功能及其体内试验提供了有效工具。