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猪血凝性脑脊髓炎是由猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)感染引起的猪的一种急性、高度接触性传染病,已成为危害我国养猪业发展的重要疫病之一。PHEV主要侵害仔猪中枢神经系统(CNS)导致其神经功能障碍,但该病毒致神经损伤的机制目前尚未阐明。在病毒与宿主长期共进化中,许多DNA/RNA病毒进化出降解、促进或劫持宿主mi RNA的分子机制,从而加速病毒感染或微调宿主细胞内环境。本课题组前期研究表明PHEV感染诱导小鼠大脑皮质miRNA/mRNA动态表达谱异常,并初步筛选到大量差异表达miRNAs参与调控PHEV感染致病。因此,本研究以PHEV感染后差异表达显著的miR-142a-5p分子为研究对象,开展其在PHEV致神经系统损伤中的生物学功能及分子调控机制研究。本研究建立了PHEV急性感染小鼠和原代大脑皮质神经元模型,为PHEV致病机制的解析提供理想的体内、体外研究支持系统。基于上述感染模型,通过qRT-PCR、原位杂交技术(FISH)检测证明,PHEV感染诱导miR-142a-5p显著上调表达,提示差异表达miR-142a-5p可能参与调控PHEV致神经损伤作用。为明确miR-142a-5p的调控功能,本研究对miR-142a-5p的靶基因进行系统鉴定。运用TargetScanMouse 6.2、miRanda、MicroT-CDS等软件预测得到106个潜在靶基因,并通过GO、KEGG、Cytoscape分析初步选择Unc-51-like kinase 1(Ulk1)为待检靶基因。通过miRNA mimics/inhibitors转染、激光共聚焦显微镜技术分析(CLSM)、双荧光素酶报告系统(DLR)、凝胶电泳迁移率检测(EMSA)等生物学实验进一步证实,miR-142a-5p特异性靶向Ulk1 mRNA 3’UTR区域,Ulk1为miR-142a-5p下游靶标并参与调控PHEV感染致病过程。为证实miR-142a-5p靶向抑制Ulk1在PHEV感染中的重要作用,本研究通过miR-142a-5p功能抑制研究发现,miR-142a-5p低表达可以降低PHEV复制增殖,且miR-142a-5p antagomir对PHEV感染小鼠脑损伤具有一定保护作用。利用透射电子显微镜技术(TEM)、DiD病毒示踪分析等证明,PHEV入侵后内化至Rab5GTP早期内体(EEs),并依赖宿主内体运输系统实现胞内转运。为揭示mi R-142a-5p促进PHEV感染的机制,本研究检测Ulk1功能异常对Rab5介导的PHEV感染周期的影响。首先,对神经元进行PHEV感染、miR-142a-5p/Ulk1差异表达等研究证明,Ulk1功能缺失上调Rab5 GTPase活性并促进PHEV内化及复制增殖。其次,通过Rab5 GTPase激活检测、内体形态观察等研究证明,PHEV有效感染依赖于Ulk1对Rab5 GTPase活性的调节。宿主差异表达miR-142a-5p不仅能够促进PHEV感染,也可以微调PHEV感染神经元的内环境致其形态发生异常。本研究通过建立Ulk1腺病毒过表达系统、CRISPR/Cas9介导Ulk1基因敲除系统的研究表明,Ulk1在促进神经元突起生长发育中发挥重要作用。对神经元形态结构定量分析表明,miR-142a-5p靶向抑制Ulk1参与调控PHEV致神经元突起退化过程,表现为轴突延伸发育不良、大量突起串珠形成、树突分枝增多、树突棘形成不稳定等。为揭示上述变性损伤的分子机制,本研究进一步探讨Ulk1及其下游因子Rab5在神经生长因子(NGF)信号转导中的作用。首先,通过CLSM、流式细胞术(FCM)等研究发现,PHEV感染下调NGF高亲和性受体TrkA磷酸化水平,并抑制Ulk1介导的NGF/TrkA内化作用。随后,通过高浓度NGF拯救、免疫共沉淀、共定位分析等研究证明,Ulk1功能缺失促进NGF/TrkA内化至激活型Rab5GTP内体,并于突起串珠病变部位发生轴突运输障碍。上述研究表明,Ulk1介导NGF/TrkA信号转导紊乱是PHEV致神经元变性受损的重要分子机制之一。综上所述,本研究揭示miR-142a-5p靶向抑制Ulk1功能在PHEV感染致神经系统损伤中的分子机制:一方面,Ulk1功能缺失促进Rab5 GTPase激活,有利于PHEV依赖Rab5GTP途径实现侵入和胞内转运,加速病毒感染周期;另一方面,高活性、不稳定的Rab5GTP内体发生轴突运输障碍,导致Ulk1/NGF/TrkA信号转导异常,从而诱发PHEV感染神经元形态异常、功能受损。该研究结果不仅为miRNA参与调控PHEV感染提供数据支持,也为深入解析PHEV的致病机理提供新的思路,具有重要的科学意义。