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目的:研究α-1,3岩藻糖基转移酶(α-1,3fucosyltransferase,FUT6)对TGF-β1诱导的人肾皮质近曲肾小管上皮细胞(Human kidney-2,HK-2)在上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中的作用,探讨2型糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)患者早期TGF-β/Smad信号通路激活的可能分子机制,为寻找与DN相关的致病基因、了解DN的遗传背景提供依据。方法:(1)选取早期出现TGF-β/Smad信号通路高表达的2型糖尿病肾病患者作为研究对象,提取患者外周血全基因组DNA,纯化后华大基因Illumina HiSeq2000高通量测序平台测序。(2)分析处理外显子测序信息,对所得变异进行注释,并与公共数据库YH、dbSNP129、8HapMapexome和thousands genome进行比对过滤,筛除已报道的基因多态性位点。对发生无义突变基因的功能及在肾脏的表达情况进行生物信息学分析。(3)根据患病基因的突变频数、检测SNP位点的质量值、是否在肾脏表达及基因功能分析,选取FUT6作为研究对象。对该DN患者的活检肾组织进行SP(过氧化物酶标记的链霉卵白素)法免疫组织化学染色,了解目的基因FUT6的表达情况。(4)用荧光标记的siRNA(Cy3-siRNA)瞬时转染HK-2细胞,倒置显微镜检测转染效率,Western blot检测FUT6基因的沉默效率。(5)为研究FUT6-siRNA干扰对EMT的影响,实验分为以下几组:①正常对照组(NC组),常规培养细胞;②TGF-β1刺激组(TGF组),TGF-β110ng/ml刺激细胞48小时;③FUT6-siRNA干扰组(RNAi组),使用FUT6-siRNA 50nM瞬时转染细胞,沉默HK-2细胞FUT6的表达;④FUT6-siRNA干扰+TGF-β1刺激组(iTGF组),使用FUT6-siRNA 50nM瞬时转染细胞沉默FUT6基因表达,随后加入TGF-β110ng/ml刺激细胞48小时。相差显微镜观察细胞形态学变化;Western blot检测FUT6蛋白的表达情况,及各组TGF-β/Smad信号系统(TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2/3和p-Smad2/3)的表达;Western blot检测EMT相关指标(E-cadherin、N-cadherin、Snail和Vemintin)的表达;另外用免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)结合凝集素印迹(Lectin blotting analysis,IB)特异性检测结合在TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ上的岩藻糖链的表达。(6)TGF-β1刺激不同时间的研究:TGF-β110ng/ml分别刺激细胞1d、2d和3d,分别标记TGF D1组、D2组和D3组。相差显微镜观察细胞形态变化;Western blot检测各组细胞FUT6、TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ的表达量的变化;IP结合ib特异性检测结合在tgf-βrⅠ和tgf-βrⅡ上的岩藻糖链的表达。结果:(1)外显子组测序发现单核苷酸变异总共38914个。通过与公共数据数据的比对过滤,共发现509个突变位点,其中包括497个错义突变和12个无义突变。发生无义突变且在肾脏高表达的基因有ankrd35、acsm2a、fut6和haao。其中fut6基因的315tac>taa,氨基酸残基由酪氨酸突变为终止密码子,免疫组化证实fut6在该患者的肾活检组织中表达量减少。(2)荧光显微镜和westernblot检测结果显示fut6-sirna在50nm和100nm浓度时均可成功干扰hk-2细胞fut6表达,沉默效率约为50%。(3)相差显微镜观察nc组细胞呈正常上皮细胞铺路石样形态;tgf组细胞肥大、拉长,呈梭形改变;rnai组与nc组细胞相比,形态几乎未发生变化;itgf组细胞形态部分发生梭形改变,但与tgf组细胞相比tgf-β1诱导的细胞形态的梭形改变较不明显。(4)westernblot结果显示,与nc组相比rnai组fut6的表达减少,而tgf组和itgf组fut6的表达量增加,说明tgf-β1刺激下fut6的表达量增加,而sirna干扰并不能抑制tgf-β1刺激引起的fut6表达量的增加。tgf组、rnai组和itgf组p-smad2/3的表达与nc组相比明显增加;rnai组和itgf组smad2/3的表达增高,而tgf组表达几乎不发生变化。tgf组snail、n-cadherin和vimentin的表达与nc组相比升高,e-cadherin表达下调,提示hk-2细胞发生成纤维化转变;rnai组snail、e-cadherin、n-cadherin和vimentin的表达几乎未发生改变;itgf组与tgf组相比,e-cadherin的表达未发生改变,而snail、vimentin和n-cadherin表达明显减少,说明用fut6-sirna干扰其表达后,能一定程度抑制tgf-β1诱导的emt。(5)ip结合凝集素印迹实验结果显示特异性结合在tgf-βrⅠ的岩藻糖基链的表达,tgf组与nc组相比基本保持不变,而rnai组和itgf组与tgf组相比表达明显下调;其变化趋势与特异性结合在tgf-βrⅡ上的岩藻糖链的变化相同。(6)tgf-β1处理不同时间相差显微镜观察,随着刺激时间的延长细胞形态发生梭形改变的趋势越明显;fut6的表达先增加后减少,其变化趋势同tgf-βrⅠ和tgf-βrⅡ;ip结合ib实验结果显示tgf-β1处理不同时间,特异性结合在tgf-βrⅠ和tgf-βrⅡ上的岩藻糖链的表达并未发生改变。结论:(1)fut6调控tgf-βrⅠ和tgf-βrⅡ的岩藻糖基链的表达。(2)fut6-sirna干扰后短期内tgf-β/smad信号系统激活。(3)抑制tgf-βrⅠ和tgf-βrⅡ的岩藻糖基化修饰能够在一定程度上抑制tgf-β1诱导的emt。结果提示FUT6可能通过对TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ的岩藻糖基化修饰影响TGF-β/Smad信号通路,从而对肾小管上皮-间充质转化产生影响。