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对于革兰氏阴性菌,毒力因子等大分子蛋白物质,需要穿透细胞膜,才能到达细胞外,甚至进入宿主细胞。革兰氏阴性菌借助于大分子的分泌系统,完成毒力因子的这一复杂的转运过程。截止目前,细菌中共发现七种类型的分泌系统,Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system, T6SS)是革兰氏阴性菌中新近发现的分泌系统,具有与Ⅲ型和Ⅳ型分泌系统(T3SS和T4SS)相类似的接触依赖性分泌方式。大约25%已测序的革兰氏阴性菌基因组中至少存在一个拷贝的Ⅵ型分泌系统编码基因簇,由15-20个基因组成,这些基因在不同菌中具有较高的保守性。核心基因包括:vasA,vasK,vasF,vasH,hcp,vgrG,vipA和vip 等,在结构上构成类似于可收缩的噬菌体尾部结构。Hcp、VgrG蛋白在构成T6SS结构的同时,还能作为效应分子被分泌到细胞外发挥功能。VasH编码Sigma-54因子依赖性的激动因子,对Ⅳ型分泌系统起调控作用。前期工作中,我们完成了一株河弧菌临床分离株VF85003基因组序列的测定和分析,生物信息学分析预测河弧菌VF85003中存在两个Ⅵ型分泌系统相关基因簇。但是,到目前为止,尚缺乏河弧菌的Ⅵ型分泌系统是否具有功能的实验证据支持,本研究对河弧菌Ⅵ型分泌系统进行了初步功能探索,为后续研究奠定基础。为了验证并确定Ⅵ型分泌系统基因簇在组织结构上的保守性和存在的广泛性,我们利用PCR选择性检测了两套Ⅵ型分泌系统相关基因在不同时间、地点和来源的河弧菌分离株中的分布。结果表明,Scaffold10.1上Ⅵ型分泌系统基因vasH、vasL/vask、vasA/vipB在所检测菌株中均存在且基因排列顺序结构与VF85003中一致,说明该Ⅵ型分泌系统基因簇在河弧菌中是广泛存在的,具有保守性。另外,在VF85003中我们以针对弗尼斯弧菌中两个hcp-vgrG拷贝上下游序列特异性的引物对,扩增出两个hcp-vgrG序列,命名为hcpA-vgrGA和hcpB-vgrGB。加上测序预测的一个拷贝的hcp-vgrG偶联基因序列,在VF85003中,至少存在三个编码Hcp和VgrG蛋白的基因片段序列。值得注意的是,VF85003中hcp-vgrG位点在其他河弧菌菌株中的检出率仅为10%,说明其并非广泛分布。利用实时荧光定量RT-PCR,我们还检测了Ⅵ型分泌系统相关基因的表达水平,发现在 OD600达 2.0 时,vgrGA、vgrGB、vasK、vasF、vasHmRNA 表达水平最高;效应蛋白编码基因hcpA、hcpB、hcp和vgrG的mRNA表达水平出现两个高峰,分别是OD600等于0.8和2.0时,提示T6SS效应蛋白基因的转录表达可能受细胞密度变化的调节。为明确三个Hcp效应蛋白编码基因的表达水平以及验证细胞密度变化对其影响,我们利用PBBR-lux报告质粒检测了三个hcp基因启动子的活性。发现hcpA的启动子活性最高,hcp因启动子活性低可能不发挥生物学功能。VasH对hcp基因的转录起到正调控的作用。Ⅵ型分泌系统受密度感应系统的调控,与霍乱弧菌密度感应调节子HapR功能一致,河弧菌中VflS对hcp基因的表达起明显的促进作用;另一转录激活蛋白VflR对hcp基因的表达也有一定的促进作用。为明确河弧菌T6SS是否具有分泌功能,我们采用Western-blot检测效应蛋白Hcp。当细胞密度OD600为2.0时,在全菌蛋白中检测到Hcp,并且在更高的细胞密度时也能检测到。在上清中,抗Hcp蛋白的多抗在与Hcp大小相同的位置上有弱的杂交条带,需进一步验证。为进一步了解河弧菌T6SS的分泌功能,我们尝试采用非标记(label free)定量质谱方法对不同条件培养上清中分泌组蛋白的表达进行了检测和比较。结果表明,高盐可促进鞭毛基因flaA、flaC、flaD的表达,vasH对鞭毛基因的表达起负调控作用。所有上清蛋白中未检测到T6SS分泌蛋白Hcp、VgrG或其他效应-免疫蛋白的同源蛋白,提示可能在目前的培养条件下,河弧菌VF85003的Ⅵ型分泌系统没有分泌活性,其生物学功能和需要激活表达的环境条件因子有待进一步探索。