红松(Pinus koraiensis Sieb.et Zucc.),作为阔叶红松林的建群种,是我国东北东部山区极其重要的珍贵乡土优质用材林和坚果经济林树种。本研究通过筛选和建立胚性愈伤组织超低温保存方案,进一步优化红松体胚发生体系,同时对不同类型愈伤组织和红松体胚不同发育时期的形态及生理进行探究,以阐述红松体胚发生与外源添加物质的关系,揭示不同类型愈伤组织之间的形态和生理与体胚发生潜力之间、体胚发育与形态和生理变化之间的关系。主要结果如下:(1)在红松胚性愈伤组织诱导过程中,外植体母树来源显著影响胚性愈伤组织诱导率,28株母树中只有10株母树成功获得胚性愈伤组织,诱导率最高为22%,最低为2%。意味着基因型在胚性愈伤组织诱导中可能起到决定性作用。(2)在红松体胚成熟培养过程中,最佳培养方式为分散培养(91个·g-1FW愈伤组织),最佳成熟培养基为mLV+80 μmol·L-1 ABA+1.2%结冷胶+0.2 mol·L-1蔗糖,最佳细胞密度为50 mg愈伤组织每皿。其中,0.2 mol·L-1蔗糖处理对促进体胚发生数量影响最大(9.3倍),1.2%结冷胶处理对促进体胚发生数量影响次之(7倍),mLV培养基处理对促进体胚发生数量影响最小(2.1倍)。此外,体胚数量对成熟培养方式、培养基类型、ABA浓度和结冷胶浓度的响应程度有强烈的基因型依赖性,同时发现胚性愈伤组织在继代培养6个月后开始逐渐丧失体胚发生潜力。该结果说明,胚性愈伤组织的基因型及生理状态与体胚发生的潜力密切相关,而一定的外源添加物质可以促进体胚发生。(3)红松体胚发育过程中,1～7d时裂生多胚向早期单胚早期发育,7～14d时早期单胚早期向早期单胚后期发育,14～21 d时早期单胚后期向后期单胚发育,21～28 d时后期单胚向早期子叶型胚发育,28～34d时早期子叶型胚向中期子叶型胚发育,34～60 d时中期子叶型胚向成熟子叶型胚发育。在这期间,鲜重和干重比随时间延长而增加,含水量则逐渐下降,到子叶型胚时期降到最低;可溶性蛋白28 d时达到最高(15.68 mg·mg4 FW愈伤组织),可溶性糖14 d时达到最高(10.40 mg·mg-1 FW愈伤组织);淀粉含量35 d时达到最高(12.51 mg·mg-1FW愈伤组织);同时SOD活性在体胚发育过程中呈双峰型,其中7 d和28 d为积累高峰;POD和CAT活性呈单峰型,均在14 d时达到累积高峰。说明体胚发生过程是一个能量储存的过程,同时抗氧化酶之间相互配合调节这体胚的发生和发育。(4)胚性愈伤组织相较于非胚性愈伤组织和丧失体胚发生潜力愈伤组织的细胞形态具有较大的细胞核,细胞之间排列更为紧密,形成团状体,其中,胚性愈伤组织细胞内具有高含量的可溶性蛋白(3.98mg·g-1FW愈伤组织)、可溶性糖(2.54mg·g-1 FW愈伤组织)、淀粉(16.29 mg·g-1 FW愈伤组织)和脯氨酸(0.18mg·g-1 FW愈伤组织);同时具有低水平的多酚含量(0.19mgg-1FW组织愈伤),多酚氧化酶(4.06μmol·min-1.g-1 FW愈伤组织)、SOD(70.86 U.g-1·FW愈伤组织)和POD(0.05 U·mg-1·FW愈伤组织·min-1)活性。说明较大的细胞核和紧密的细胞排列以及高含量的贮藏物质、低水平的多酚、多酚氧化酶和抗氧化酶可以作为具有体胚发生潜力愈伤组织的形态和生理标记物。(5)红松胚性愈伤组织超低温保存过程中,预培养条件、冷冻剂浓度和解冻温度均显著影响其细胞存活率,最佳超低温保存条件为:0.4 mol·L-1山梨醇溶液预培养18 h,加入10%DMSO冷冻保护剂。复苏培养14 d后愈伤组织存活率达到90%。总之,本研究进一步表明,基因型在红松胚性愈伤组织诱导和体胚成熟过程中均起到决定性作用,同时愈伤组织的生理状态也显著影响体胚的发生潜力,此外,体胚发生过程中形态变化与生理变化具有紧密联系。这些研究结果,对加速红松良种选育和快速规模化繁殖,深入了解红松体胚发生分子机理具有重要的理论意义。