牛肠道病毒（Bovine enterovirus,BEV）感染是国内近年来报道的一种临床上以消化道、呼吸道症状为特点的新发传染病,其病原体属于小RNA病毒科肠道病毒属中的成员。目前,牛肠道病毒分为E种和F种两个肠道病毒种,两者间的核苷酸序列差异较大,属于不同的血清型/基因型,常规血清学方法难以将其区别,同时国内尚未见有鉴别E种和F种肠道病毒感染的诊断方法。肠道病毒非结构蛋白3A是一种由89个氨基酸组成的膜结合蛋白,由可溶性N端（58个残基,对称二聚体）与含有22个残基（氨基酸59-81）的疏水区及含有7个氨基酸残基的C端组成,其功能尚不十分清楚。对3A蛋白的结构研究发现,C端有一个强疏水区域,分为两部分（I:氨基酸64-72;II:氨基酸73-80）,区域II可能参与介导3A、3B在RNA合成的启动过程与膜的结合。同时,该疏水区域氨基酸的改变可导致病毒复制缺陷和死亡。本研究基于目前国内尚未见有鉴别E种和F种肠道病毒感染的方法及缺乏研究牛肠道病毒3A蛋白功能的相关检测试剂,根椐Gen Bank已发表的E种和F种肠道病毒的基因组序列,设计合成两对引物,建立了鉴别E种和F种肠道病毒感染的双重PCR方法,确定了该方法的特异性、敏感性和重复性,并初步将该方法应用于检测长春地区疑似牛肠道病毒感染的样品。结果显示,建立的方法具有良好的特异性,只能检测出E种和F种肠道病毒。敏感性试验结果显示,E种和F种肠道病毒病毒最低检出量分别为3.67×10~2拷贝/μL和5.21×10~3拷贝/μL。对长春地区的32份疑似牛肠道病毒感染的样品进行检测,结果显示,E种和F种病毒的检出阳性率分别为28.13%和34.38%,两个种型肠道病毒混合感染率为15.63%。此外,本研究应用RT-PCR扩增出HY12毒株的3A基因序列,并将其克隆到原核表达载体,构建重组蛋白的原核表达质粒p GEX-4T-3A。以纯化表达的牛肠道病毒非结构蛋白3A作为免疫原对小鼠进行免疫,获得的免疫脾细胞经PEG与骨髓瘤细胞融合,以间接ELISA方法筛选分泌3A蛋白的单克隆抗体,并对获得的20株针对3A蛋白的单克隆抗体进行了亚型鉴定。应用免疫印迹和免疫荧光实验鉴定了其中5株单克隆抗体与HY12毒株的反应性,并以分段检测抗原表位方法确定了两株单抗识别的肽段序列为31NEEVREYCRSKGWIV45,该区域经氨基酸序列比对分析,在E种肠道病毒中较为保守,而在F种肠道病毒中差异较大。免疫荧光实验结果显示,单抗3A6、3B2只能识别出E种肠道病毒,而不能识别出F种肠道病毒、牛细小病毒和牛病毒性腹泻病毒。综上所述,本研究首次在国内建立了鉴别不同种型牛肠道病毒感染的双重PCR方法,该方法特异性强,灵敏度高,且具有一步同时检测E种和F种两种肠道病毒的快速简便等优点,同时,制备出抗HY12毒株非结构蛋白3A的单克隆抗体,确定出单抗3A6、3B2的抗原识别关键区域,明确了单抗3A6、3B2只能识别出E种肠道病毒,而不能识别出F种肠道病毒、牛细小病毒和牛病毒性腹泻病毒。上述结果为今后牛肠道病毒感染种型鉴别和流行病学调查提供了一种技术手段,并为进一步研究HY12毒株3A蛋白功能及开发相关检测方法奠定了基础。