旋毛虫（Trichinella spiralis）可以引起全球范围内危害严重的食源性人兽共患寄生虫病,严重威胁人类健康,给畜牧养殖业造成巨大的经济损失。感染者的临床症状通常表现为颜面部水肿、发热、肌肉酸痛和心肌炎等,严重时甚至可造成死亡。旋毛虫在宿主体内侵袭过程中可以直接激活巨噬细胞来引发宿主产生强烈的Th2型免疫反应,使周围形成一个高度抗炎的环境,从而抵抗旋毛虫感染。胞外囊泡（Extracellular Vesicles,EVs）通过其内部包裹的生物活性分子,可以在各种病理和生理条件下介导寄生虫-宿主的相互作用过程,调控宿主的基因表达和免疫反应,参与寄生虫侵袭过程。研究证实,潜在的免疫调节性蠕虫衍生物可以预防或治疗自身免疫性疾病,这为后续的临床应用提供了广阔的前景。此外,寄生虫EVs可以引起宿主不同程度的免疫应答反应,前期研究也证明旋毛虫肌幼虫期胞外囊泡（Ts-ML-EVs）通过抑制Th1细胞增殖、调节Th17/Treg细胞的平衡而对TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎具有免疫调节作用,且可以引起巨噬细胞向M2型极化,从而对DSS诱导小鼠结肠炎有免疫保护作用。但目前有关Ts-ML-EVs的具体组成,如蛋白质和miRNA等,以及其调控宿主的免疫应答机制还尚未可知。因此本课题拟对Ts-ML-EVs的表达特征及免疫保护效果进行探究,这一结果将有助于我们进一步了解旋毛虫病的致病机制,也为旋毛虫病的防控研究奠定基础。本研究首先通过差速超速离心法分离Ts-ML-EVs,TEM观察到囊泡呈典型的磷脂双分子层囊泡状结构,大小在30-180 nm之间,NTA表明,囊泡的粒径峰值在126 nm。流式细胞术标记其表面特异性标志物CD63和CD81,阳性率分别为48.8%和77.7%,通过Western blot鉴定Ts-ML-EVs的特异性标志蛋白Hsp70和Enolase。上述研究结果表明,我们成功获得了高纯度的TsML-EVs,且分离的Ts-ML-EVs可以用于进一步的组学鉴定。其次,为了确定Ts-ML-EVs的蛋白质和miRNA组成,本研究分别将Ts-MLEVs进行Label-free LC-MS/MS蛋白质组学分析和miRNA高通量测序。SDSPAGE结果显示,Ts-ML-EVs的蛋白大小在35-75 k Da之间,且成分稳定均一无降解,可用于下一步实验。实验一共鉴定到了753种蛋白质,这些蛋白质富集到347个信号通路中,其中最为富集的是糖酵解通路,表明Ts-ML-EVs可能参与调节肌幼虫寄生于宿主肌肉内进行的无氧呼吸活动中。miRNA高通量测序发现TsML-EVs中有1 224种已知miRNA,42种新的miRNA。q PCR结果表明,Ts-MLEVs中的miRNA含量与肌幼虫虫体存在一定差异,表明Ts-ML-EVs可能会选择性包装肌幼虫分泌的一些miRNA转移至外界,参与宿主的生物学活动。此外,靶基因预测显示,Ts-ML-EVs miRNA的靶基因多与癌症的发生和MAPK信号通路相关。最后,为了探究Ts-ML-EVs对小鼠的免疫保护作用,实验将BALB/c小鼠分为PBS对照组、IMS1313佐剂对照组以及Ts-ML-EVs免疫组,各组每隔2 w免疫一次,共3次。每次免疫前和末次免疫后2 w对小鼠眼眶采血,血清冷冻保存备用。Western blot结果表明,经过Ts-ML-EVs三次免疫后的小鼠血清具有很好的免疫原性,蛋白大小在37-75 k Da。ELISA结果显示,与其他两对照组相比,Ts-ML-EVs免疫组小鼠体内Ig G、Ig M、Ig G1和Ig G2a水平含量随着免疫的次数的增加持续上升,且Ig G1水平高于Ig G2a。Ig E含量也同样升高,但没有前几种抗体变化差异显著。同样地,细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ和IL-12含量随着免疫次数的增加均有所上升,且代表Th2型免疫反应的IL-4和IL-10更为显著,表明Ts-ML-EVs可以诱导小鼠产生以Th2型免疫反应为主的Th1/Th2混合型细胞免疫应答。此外,Ts-ML-EVs免疫组小鼠的成虫和肌幼虫减虫率分别为23.4%和43.7%。这些结果均表明Ts-ML-EVs可以诱导小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答,起到了一定的抗寄生虫作用,是一种有潜力的抗旋毛虫疫苗候选物。总之,本研究通过对Ts-ML-EVs进行蛋白质组学和miRNA测序对其进行表达特征以及免疫效果评估,肯定了其对感染旋毛虫的小鼠具有的免疫保护作用,为旋毛虫的防治研究提供新思路,也为进一步探究旋毛虫利用Ts-ML-EVs实现侵袭的机制提供实验基础和理论依据。