【摘 要】
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细胞自噬（Autophagy）能够捕获并降解细菌、病毒等多种病原体,被认为是先天免疫的一个重要组成部分。然而很多病毒在长期进化中,演变出多种机制来逃避宿主的免疫或者利用细胞自噬进行自我复制。我们研究发现苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californic multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）感染鳞翅目昆虫草地贪夜蛾（Spodoptera fr
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细胞自噬（Autophagy）能够捕获并降解细菌、病毒等多种病原体,被认为是先天免疫的一个重要组成部分。然而很多病毒在长期进化中,演变出多种机制来逃避宿主的免疫或者利用细胞自噬进行自我复制。我们研究发现苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californic multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）感染鳞翅目昆虫草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的卵巢细胞（Sf9）会引发自噬,但自噬对病毒增殖的影响以及自噬的分子机制尚未阐明。本论文以草地贪夜蛾作为研究对象,通过多种实验方法获得AcMNPV感染引发Sf9细胞发生自噬的证据,探讨改变宿主细胞自噬水平对AcMNPV增殖的影响,进一步通过转录组分析病毒引起草地贪夜蛾脂肪体中基因表达的改变,为探究病毒引发自噬的分子机制奠定工作基础。论文获得的主要结果如下:1.通过Bac-to-Bac系统构建了重组病毒EGFP-AcMNPV,感染Sf9细胞（MOI=8）,在感染24h观察到绿色荧光,24h-48h荧光明显增强,表明病毒进行了大量复制和繁殖。通过实时荧光定量PCR技术,检测Sf9细胞在EGFP-AcMNPV感染后自噬相关基因的表达变化,结果表明:多数检测的自噬相关基因在病毒感染6h-12h表达量上调,暗示AcMNPV感染Sf9使细胞能够引发自噬响应。2.AcMNPV感染Sf9细胞,通过Lyso Tracker Red染色利用激光共聚焦显微镜对细胞中发生的自噬溶酶体进行观察并统计分析,显示病毒感染的Sf9细胞中自噬溶酶体的数量比对照显著增加;通过Western blot检测ATG8蛋白水平,显示感染后24h-48h细胞中ATG8向ATG8-PE的转化明显增多,表明AcMNPV感染Sf9细胞能够诱导细胞发生自噬响应。3.使用自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin）和自噬抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）处理Sf9细胞后进行EGFP-AcMNPV感染,检测自噬水平的改变对病毒增殖的影响。当以自噬诱导剂处理Sf9细胞时,荧光显微镜观察显示处理的细胞中绿色荧光比对照明显增加,说明病毒的复制和增殖增加;TCID50法测定的病毒滴度和Western blot检测的EGFP蛋白表达量也都证明了雷帕霉素处理有利于病毒的增殖,表明Sf9细胞中自噬增强有利于病毒的复制。自噬抑制剂CQ处理的结果相反,病毒的复制和增殖减少。上述结果说明在感染Sf9细胞的过程中,病毒利用宿主的细胞自噬促进自身增殖。4.在病毒感染早期30min至6h,总AKT表达没有明显变化,p-AKT水平迅速增加;PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002能使ATG8的转化形式ATG8-PE增加,说明细胞自噬水平增强,同时病毒的复制增加。初步说明PI3K/AKT信号途径参与了病毒感染引发自噬的过程。5.AcMNPV感染Sf9细胞48h时,细胞核变大,细胞形态异常。细胞流式结果显示,感染后24h细胞开始凋亡;感染36h-48h,发生明显的凋亡,表明AcMNPV感染的Sf9细胞中发生自噬和凋亡两种程序性死亡。6.草地贪夜蛾幼虫注射AcMNPV,对脂肪体进行转录组测序,在病毒感染24h,抗菌肽（AMP）、凋亡抑制结构域（Inhibitor of Apoptosis domain）、磷脂酰肌醇3-和4-激酶（PI3/4K）、膜转运受体（transmembrane receptor）等基因明显上调,KEGG富集分析显示,溶酶体、自噬、凋亡、Toll和Imd、PI3K/Akt、m TOR等信号通路等都有富集现象。上述研究有助于我们进一步深入理解AcMNPV与草地贪夜蛾之间的相互关系,为病毒杀虫剂用于鳞翅目害虫的防治实践提供理论依据。
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