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目的:
1、在“三套管”法的基础上,建立大鼠左肺原位移植的最佳模型,为进一步研究诱导大鼠肺移植术后免疫耐受状态提供动物模型。
2、建立大鼠骨髓源性树突状细胞(DC)的体外培养和扩增方法,并通过脂质体转染质粒sTNFRI-IgGFc基因,观察、测定DC细胞的生物学特性。
3、探讨sTNFRI-IgGFc基因修饰的树突状细胞诱导大鼠肺移植术后免疫耐受的可能机制。
方法:
1、外科显微放大镜下采用“三套管法”完成大鼠同种异体左肺原位移植模型,通过手术成功率、手术时间、病理学改变等指标评估模型的可行性。
2、利用重组大鼠粒细胞.巨噬细胞集落刺激因子(rrGM-CSF)和重组大鼠白细胞介素-4(rrIL-4)诱导Wistar大鼠骨髓细胞分化成为DC细胞,于培养第5天收集细胞分组,并行脂质体介导的质粒sTNFRI-IgGFc基因转染,第7d加入LPS刺激。第9天行DC细胞形态学鉴定和功能测定。包括形态观察、细胞免疫表型的流式细胞仪鉴定,通过制备负载供体抗原的受体DC细胞与受体脾脏T细胞性单向淋巴细胞反应,观察各组刺激T细胞增殖情况;最后采用酶联吸附试验(ELISA)测定细胞培养上清中细胞因子水平(sTNFRI、IL-12,TNF-α)的含量。
3、将SD大鼠做为供体、Wistar大鼠做为受体。分为对照组、imDC组、sTNFRIIgGFc-DC组,每组20只大鼠,行10例左肺原位移植。每组分别注射100ulPBS、imDC(数量为1×106,悬于100ulPBS中)、100ulsTNFRIgGFc-DC
(数量为1×106,悬于100ulPBS中),于术前7天、术前、术后7天共3次静脉注射。每组随机取5只大鼠于移植后第7天处死,做相关检测,包括受鼠脾脏T细胞的单向淋巴细胞反应、血清细胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、TNF-α)水平,剩余5只观察存活情况。
结果:
1、完成大鼠左肺原位移植正式实验25例,20例存活,5例死亡,成功率80%。供肺灌洗到获取完成时间(10±1)min,体外套管时间(10±1)min,供受体动静脉和支气管吻合时间(40±2)min。对移植肺(n=5)行夹闭实验,阻断右侧肺门,单肺通气维持20min,大鼠心跳呼吸平稳。受鼠于术后7天内均存活
2、所获得的DC细胞在光镜和电镜下均表现为DC的典型形态,流式细胞仪表型检测也为典型DC的特征。sTNFRIIgGFc-DC在细胞表型和MLR、细胞因子分泌上具有不成熟DC的特征:能分泌大量的sTNFRI,还能拮抗LPS的促熟作用。
3、sTNFRllgGFc-DC组刺激T细胞增殖能力弱于对照组和imDC组(p<0.05),而IL-4、IL-10水平明显高于对照组和imDC组(p<0.05),IL-2、IFN-γ水平低于前两组(p<0.05);TNF-α含量基因转染组明显低于前两组(p<0.05)。在病理切片上,也可见sTNFRIIgGFc-DC组炎症反应轻。
结论:
1、通过“三套管”法建立了稳定的大鼠左肺原位移植模型
2、成功建立了大鼠骨髓源性DC细胞的体外培养和扩增,并通过脂质体转染质粒sTNFRI-IgGFc基因,制备了具有抗LPS成熟和高表达sTNFRI-IgGFc基因的能“致耐受”的DC细胞。
3、sTNFRI-IgGFc基因修饰的树突状细胞能够诱导大鼠肺移植术后免疫耐受,延长移植物存活。可能的机制为sTNFRI-IgGFcDC细胞低表达的CD80、CD86,导致T细胞活化的第二信号缺失,产生免疫偏移有关,也可能和sTNFRI-IgGFc高效阻断、封闭受体体内TNF-α活性有关。