研究背景骨关节创伤、肿瘤切除以及感染等多种原因均可导致骨缺损。而骨缺损的修复一直以来是骨科医师们所面临的一项重大难题,目前临床上所常用的修复方法,如自体骨移植、异体骨移植等均存在不足之处,难以满足临床上治疗的需要。近年来,伴随着骨组织工程技术的兴起和蓬勃发展为骨缺损的修复和重建开辟了崭新的领域。磷酸钙人工骨因良好的相容性、可被骨组织完全降解而成为组织工程学方法修复骨缺损支架材料的研究热点。磷酸钙人工骨作为骨缺损组织工程支架材料可为成骨细胞的长入提供支撑结构,有利于细胞的粘附、营养物质的交换,并有利于细胞增殖和分化并向支架内部迁移,为细胞生长提供合适的外部环境,同时磷酸钙人工骨的三维支架结构还能起到模板作用,引导组织再生和组织结构修复,做为一理想的组织工程支架材料应具有组织再生相匹配的降解速度,能促进组织再生的化学表面和一定的力学强度。但在相关的研究中发现孔隙率及孔隙大小被认为是影响磷酸钙人工骨降解的主要因素。因此,提高磷酸钙人工骨三维支架内部孔隙之间的联通性,是获得力学强度与降解速度之间的平衡的一可能有效方法。本课题组在前期的研究中制备的枝状孔结构多孔磷酸钙人工骨,获得了支架结构内疏松层状、网络状的磷酸钙人工骨支架,提高了三维结构内部的孔隙的联通性,并保持了磷酸钙人工骨的力学强度,获得了满意的实验效果。随着人们对支架材料性能要求的进一步提高,单相的生物支架材料已经难以满足临床的要求,加之磷酸钙人工骨虽具有良好的骨传导性,却无明显的骨诱导性,因此复合种子细胞是解决该问题的有效途径。干细胞具有多向分化性,控制体外培养条件可使干细胞向成骨细胞、成软骨细胞等方向分化。目前骨髓间充质干细胞具有多分化潜能,可分化成纤维细胞、成骨细胞等,增值能力强,来源广泛,取材方便,供区损伤小,因而倍受人们的关注。在体内试验中,以骨髓间充质干细胞作为种子细胞的组织工程骨在骨缺损修复的基础研究取得较为满意的效果。生物活性因子作为构建组织工程的三大要素之一,在促进骨修复过程中发挥极其重要的作用。影响新骨形成研究较为深入的生物因子为骨形态发生蛋白(BMPs),BMP对骨原细胞的分化起决定性作用,是促进成骨的主要因子。其中BMP-2是转化生长因子β(TGF-β)超家族中的多功能细胞因子,可在骨组织损伤局部及异位促进细胞增殖,提高碱性磷酸酶活性,使其在骨组织疾病特别是骨缺损、骨折的临床治疗中具有极大的潜在应用价值。大量实验证实将BMP-2直接或通过载体局部应用可促进骨形成。骨组织工程中骨血管化也是一个关键环节,充足的血供不仅有利于种子细胞的存活、增殖和分化,还可加速新骨的形成,加快骨缺损的修复,而VEGF是公认为作用最强,特异性最高的促血管生成因子之一。在骨组织工程中,将生长因子整合到支架材料上后其体内半哀期短,难以保持局部有效治疗浓度,而近年来发展的缓释技术则存在操作复杂、包封率低且有效安全的局部剂量难以达到等问题。随着基因工程技术的发展,将生物因子基因体外转染种子细胞,使种子细胞转染的目的基因编码的生长因子或细胞因子能在局部组织高效表达被认为是维持骨缺损局部生物活性因子有效治疗浓度最具有发展前景的一种方法。同时单一的生物活性因子促进组织生长作用局限,联合多种生物活性因子可产生协同作用。因此,我们在改善支架材料理化性能的基础上尝试应用BMP-2和VEGF165双基因转染骨髓间充质干细胞,从而利用构建基因治疗策略使局部组织持续、稳定的释放骨诱导因子和血管化生长因子,同时复合支架材料构建有活性的组织工程骨,促进体内局部成骨及其血管化,进而增强骨缺损的修复能力。本实验研究是在上述思路下和本课题组前期研究的基础上,采用BMP-2及VEGF165双基因转染的MSCs与磷酸钙人工骨支架材料进行复合,并对该双基因修饰组织工程骨的理化性能、力学性能、生物相容性进行综合评价,为新材料的临床应用提供实验依据。研究目的1.探讨BMP-2及VEGF165双基因修饰磷酸钙人工骨复合支架的制备方法及其表征、性能;2.观察BMP-2及VEG165F双基因转染的MSCs在磷酸钙人工骨复合支架上的粘附、增殖及分化等生物行为。研究方法1.BMP-2及VEGF165双基因修饰磷酸钙复合支架(Scaffold 2,以下简称S2,单纯磷酸钙支架Scaffold 1,以下简称S1)的制备及表征(1)多孔磷酸钙支架及BMP-2及VEGF165双基因修饰磷酸钙复合支架的制备:采用分步沉淀负压吸附法将BMP-2及VEGF165双基因转染的MSCs,移植到磷酸钙人工骨支架上制备成双基因修饰磷酸钙人工骨复合支架;(2)BMP-2及VEGF165双基因修饰磷酸钙复合支架的表征采用超高分辨率场发射扫描电子显微镜进行检测和X射线衍射分析支架内部空间三维结构的变化,并通过万能测试机测试抗压强度、扫描电子显微镜观察表面形貌以及阿基米德法测定孔隙率。2.BMP-2及VEGF165双基因修饰磷酸钙复合支架的细胞相容性将BMP-2及VEGF165双基因转染的MSCs接种于磷酸钙支架材料上进行共培养为实验组,单纯BMP-2及VEGF165双基因转染的MSCs培养为对照组。在倒置相差显微镜下观察双基因转染的MSCs在支架内部的贴附情况,在扫描电子显微镜下观察双基因转染的MSCs在材料上生长情况,沉淀法和MTT法检测双基因转染的MSCs的粘附和增殖情况,碱性磷酸酶试剂盒测定细胞碱性磷酸酶活性变化,茜素红钙结节染色观察双基因转染的MSCs矿化能力的变化。研究结果1.X射线衍射分析结果表明样品材料96%为Ca3(P04)2,平均粒度为70.1nm。超高分辨率场发射扫描电子显微镜测试表明磷酸钙粉中的颗粒粒径43-90nm,颗粒大小不等,存在团聚现象,在S1基础上采用分布负压吸附沉淀法成功制得S2复合支架。2.通过电镜观察,S1与S2两种支架均具有良好的三维多孔结构,孔径分别为(330.4±47.2)μm和(325.1±50.6)μm,差异无统计学意义(P=0.405);采用阿基米德法测定孔隙率分别为82.1±0.6%和80.0±0.5%,具有明显统计学意义(P<0.001);X射线衍射分析结果表明:S1支架与磷酸钙原材料的衍射峰基本相似,与MSCs复合培养两周后S2支架的X射线衍射图表现为一定的非晶体衍射峰特点;生物力学测试结果显示抗压强度分别为(4.4±0.3)MPa和(4.5± 0.2)MPa,S1与S2无显著性差异(P=0.256)。3.双基因转染的MSCs与磷酸钙支架成功复合后能良好的粘附、增殖,并向支架孔内生长。随着时间的延长,细胞粘附率逐渐增大,4h与2h相比差异无显著性(P=0.072);8h、12h分别与之前的时间点相比,差异均有显著性差异(P<0.001)。MTT检测双基因转染的MSCs在磷酸钙支架中生长良好,OD值均随时间延长而增大,同组各时间点比较,差异均有统计学意义(P<0.001);各时间点组间比较,在培养1d(P=0.179)和3d(P=0.114)时两组间无显著性差异(P>0.05);培养7d时OD值对照组高于实验组,两组间有显著性差异(P<0.001)。复合于支架材料的双基因转染MSCs碱性磷酸酶的活性逐渐升高,培养1d(P=0.083)时两组间无显著性差异(P>0.05);培养3d(P=0.002)、7d(P<0.001)天时,MSCs的ALP的活性实验组明显高于对照组,两组间均有显著性差异(P<0.05),。培养1d(P=0.083)时两组间无显著性差异(P>0.05);培养3d(P=0.002)、7d(P<0.001)天时,MSCs的ALP的活性实验组明显高于对照组,两组间均有显著性差异(P<0.05),说明支架材料能促进MSCs的成骨分化。支架材料与双基因转染的MSCs共培养3周后,经茜素红染色,可见大小不一、形态各异的红色结节,与对照组相比,实验组的矿化结节数目和面积明显增加。研究结论1.BMP-2及VEGF165双基因修饰磷酸钙复合支架具有高孔隙率、合适的孔径和孔与孔之间的贯通性,其生物力学特性达到了组织工程对支架材料的性能要求。2.BMP-2及VEGF165双基因修饰磷酸钙复合支架属于无细胞毒性的生物材料,具有良好的生物相容性,双基因转染的MSCs可以良好地粘附并生长,符合作为骨组织工程材料基本条件。