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研究背景:NUT癌(NUT Carcinoma)是一种组织起源不明的罕见的恶性肿瘤,多发于青少年中线器官,因此又被称为NUT中线癌(NUT Midline Carcinoma,NMC)。在NMC细胞中,NUT基因发生染色质易位,与BRD4基因编码区融合,翻译出新的融合蛋白BRD4-NUT。BRD4-NUT蛋白通过BRD4部分的串联双溴域(tandem bromodomains)识别组蛋白尾端的乙酰化赖氨酸,而NUT部分能够结合乙酰基化转移酶p300,并招募p300蛋白到染色质上,激活p300蛋白的乙酰基转移酶活性。因此,BRD4-NUT蛋白能招募并激活p300蛋白催化活性,使染色质发生超乙酰化,改变染色质结构,激活癌基因表达,促进癌细胞增殖、去分化和永生化。NMC是一类极难治疗的鳞状细胞癌,其侵袭能力极强,通常在确诊时癌细胞已发生大范围转移,平均生存期仅为6.7个月。目前针对NMC的治疗方法较少,传统的手术或放化疗预后效果较差,因此靶向治疗成为了新的研究重点。BET(Bromodomain and Extra-terminal)家族蛋白抑制剂能够抑制BRD4-NUT蛋白串联溴域(Br D)与染色质之间的结合,被应用于NMC靶向治疗的临床实验。但是,初步临床实验结果显示,BET抑制剂仅对20%的患者有敏感疗效,患者长时间使用后还会产生耐药反应。由于BET抑制剂对所有BET蛋白家族的蛋白均有抑制效果,所以BET抑制剂选择性较差,毒性较高,患者在使用时会出现多种并发症。因此科学家需要研发选择性更高的BET抑制剂,或者开发靶标NMC的新位点的创新型替代治疗方法。p300蛋白是一个包含多个功能结构域的大蛋白。BRD4-NUT蛋白通过NUT部分能与p300蛋白相互作用,导致p300蛋白乙酰基转移酶活性的异常增强。在NMC细胞中敲低BRD4-NUT蛋白水平,可以减低p300蛋白的催化活性,抑制肿瘤细胞增殖。因此,抑制p300蛋白与BRD4-NUT蛋白结合,或可成为降低p300蛋白酶活性,治疗NMC新的研究思路。目前,已用于临床实验的p300蛋白抑制剂主要针对其具有乙酰基转移酶活性的催化结构域HAT(Histone Acetyl-transferase)为靶点而设计。数据显示,p300-HAT结构域抑制剂可有效抑制多种癌细胞的增殖,但由于p300蛋白的HAT结构域是染色质组蛋白赖氨酸乙酰化关键催化酶,对正常细胞生长发育具有重要作用,完全抑制p300-HAT活性可能会影响正常细胞的生长发育。因此,探索BRD4-NUT激活p300蛋白酶活性的结构机制,解析p300蛋白其他结构域的调控机理,可为研发新型p300蛋白抑制剂提供理论依据。液-液相分离(Liquid-Liquid Phase Separation,LLPS)是指两种液体不溶于一种均一液相中,产生了不同的相-相分离的现象。细胞中某些蛋白质或核酸等生物大分子间可通过多价相互作用,局部浓缩,使得原本均一存在于细胞中的大分子突破溶解度阈值,进而产生新相并分离,呈现出液-液相分离的特征。生物大分子的液-液相分离与许多生物功能密切相关,如压力应激反应、DNA损伤修复、基因转录调控等,是近年来快速发展的研究新领域。液-液相分离通常发生于具有多价相互作用的分子中,这类分子包括:(1)具有多个分子间相互作用结构域的蛋白;(2)包含能提供多种弱相互作用的固有无序区间(Intrinsic Disordered Region,IDR)的蛋白。由于BRD4-NUT蛋白的NUT部分含有大量固有无序区域,因此我们设想,BRD4-NUT蛋白在细胞中通过NUT部分的LLPS的方式富集,并凝聚多种相关的转录因子,共同发挥生物学功能。上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是指上皮细胞在形态学上发生变化,向间充质细胞表型转变并获得迁移能力的过程。EMT是一种对胚胎发育、伤口愈合以及肿瘤转移有着重要作用的细胞程序。正常情况下,EMT途径受到如SNAIL,TWIST等EMT转录因子(EMT transcriptional factor,EMT-TF)的精准调控。但受多种因素影响,癌细胞中EMT-TF常处于异常活化或异常表达的状态,促进癌细胞转移。ALX1蛋白是ALX蛋白家族的一员,它能够介导脊椎动物间质源性细胞的生存和发育,其突变将阻止额鼻和上颌的融合。近期研究发现,ALX1蛋白可上调SNAIL蛋白表达,进而促进卵巢癌、肺癌、黑色素瘤等多种癌症细胞侵袭和转移。据报道,与正常细胞相比,ALX1蛋白在NMC细胞中表达水平过高,但具体功能未知。我们分析,NMC细胞中ALX1蛋白高表达可能是导致EMT途径异常活化,促进NMC细胞转移的关键。研究目的:探究BRD4-NUT蛋白与p300蛋白相互作用的结构机制,以及BRD4-NUT蛋白通过液-液相分离调控基因表达促进细胞侵袭的分子机制,为NUT中线癌的治疗提供新的治疗靶点。研究方法:结构上,通过表达纯化不同NUT蛋白截短体,利用GST pulldown和NMR HSQC实验确认NUT蛋白质结合p300-TAZ2结构域的关键序列;通过多维核磁共振技术解析NUT与p300-TAZ2复合物的高精度液体结构;机制上,在体外,纯化带有EGFP蛋白标签的NUT蛋白质EGFP-NUT以及带有Cherry蛋白标签的p300-TAZ2蛋白质Cherry-TAZ2,利用激光共聚焦显微镜研究NUT蛋白质LLPS性质;通过体外乙酰化实验检测NUT与p300相互作用对p300乙酰基转移酶活性的影响;在细胞内,借助FRAP等实验确认EGFP-BRD4-NUT蛋白在细胞内是否以液-液相分离形式凝集,并用免疫荧光实验(IF)分析EGFP-BRD4-NUT凝聚物的组成成分;构建NUT关键结合序列删除的EGFP-BRD4-NUT突变体(EGFP-BRD4-NUT-F1c),研究NUT/p300相互作用对p300蛋白酶活性以及基因转录的影响;最后,利用荧光定量PCR、免疫印迹以及染色质免疫共沉淀技术探究BRD4-NUT蛋白促进细胞上皮-间充质转化作用机制。研究结果:(1)NUT蛋白包含两个p300-TAZ2结构域结合基序;(2)x Px xx基序在结合p300-TAZ2结构域后,可折叠为α螺旋结构,是p300-TAZ2结构域识别的关键基序之一;(P代表Pro,为疏水氨基酸,x为任意氨基酸);(3)NUT蛋白质可在体外以LLPS的液滴形式存在,与p300-TAZ2结合可促进NUT/TAZ2复合蛋白的LLPS的液滴的形成;(4)在细胞核内的染色质上,BRD4-NUT通过富集转录机器相关的蛋白质复合物,形成液态相分离的核斑点,参与调控基因表达;(5)BRD4-NUT结合在ALX1基因启动子位点上,促进ALX1基因表达,从而介导上皮-间充质转化发生。