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目的：
本次研究结合急性脊髓损伤（acute spinal cord injury, ASCI）的研究现状和热点，基于导师的临床经验，以通过抑制水通道蛋白4（aquaporin4, AQP4）的表达从而减轻ASCI后脊髓水肿为切入点，旨在探讨通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减治疗ASCI的可能作用机制，以期为推广通腑逐瘀法治疗ASCI提供理论依据。
方法：
第一部分：10周龄SD大鼠30只，按随机数字表法随机分为假手术组（A组）、自制打击器2cm组（B1组）、自制打击器4cm组（B2组）、NYU组1.25cm组（C1组）、NYU组2.5cm组（C2组），每组各6只。除Sham组外，其余各组采用改良Allen’s法造模。B1、B2组将9g打击杆分别从2cm、4cm处自由坠落撞击T10脊髓，C1、C2组使用NYU打击器分别从1.25cm、2.5cm处撞击T10脊髓。各组造模完成后分别于1、3、5、7d进行BBB评分和Reuter评分，7d后行灌注取材，石蜡包埋切片，尼氏染色，观察各组组织受损程度和神经元存活率。
第二部分：10周龄SD大鼠60只按随机分配方法随机分为假手术组（Sham）、模型组（Model）、抵当汤组（DDD）、TGN-020组（TGN-020）和抵当汤联合TGN-020组（DDD+TGN-020），每组各12只。Sham组仅打开椎板暴露脊髓但不损伤脊髓；其余各组均采用自制脊髓打击器从40mm高度对脊髓进行打击。Sham组和Model组术后不予任何治疗措施干预，DDD组于术后3d予以抵当汤加减每日灌胃，持续3d，根据大鼠与人用药剂量体表面积换算法，DDD组大鼠每日用药剂量为5.04g/kg，采用蒸馏水进行稀释一定比例配制后予以灌胃处理，每日早晚各1次。TGN-020组处理方法：腹腔注射给药，每日用药剂量为5mg/kg，给药时间为3d。DDD+TGN-020组处理方法：予TGN-020腹腔注射给药，随后给予DDD灌胃处理。干预结束后进行行为学评价（BBB评分、斜板实验及Reuter评分）观察大鼠神经功能恢复情况，取材后进行脊髓组织大体观察和含水率检测、HE染色观察组织受损程度，尼氏染色观察神经元形态，免疫荧光检测各组脊髓组织AQP4、GFAP共表达的阳性细胞个数， Western Blot法检测各组脊髓组织中AQP4、GFAP、CSPG、PCNA、NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量，qPCR法检测各组脊髓组织中CSPG、PCNA基因的表达量，电镜下观察各组髓鞘和神经元组织形态，高尔基染色观察树突和树突棘形态。
第三部分：8周龄SD大鼠40只随机分为空白血清组和含药血清组，含药血清组给予5.04g/kgDDD灌胃，持续3d，空白血清组予等剂量超纯水灌胃，持续3d，干预结束后提取血清备用。每次取胚胎大鼠8-12只，通过机械-酶消化法提取星形胶质细胞（Astrocytes，AS），细胞采用10%的高糖培养基培养，观察细胞传代至第3代进行后续实验。首先，免疫荧光鉴定细胞中GFAP含量，随后进行实验分组：空白组（Control group， CG）、模型组（Model group，MG）、空白血清组（Blank serum group， BSG）、DDD含药血清组（DDD）、TGN-020干预组（TGN-020）、DDD联合TGN-020组（DDD+TGN-020），除MG外，其余各组均以划痕法进行造模，造模完成后DDD予以含药血清干预，BSG予以等剂量空白血清干预， TGN-020予以100nmTGN-020干预， DDD+TGN-020先予TGN-020干预后再予DDD干预。MTT法检测DDD含药血清干预AS的安全干预浓度、最佳干预时间和干预浓度，MTT法检测各组对RAS活性的影响，免疫荧光染色法检测RAS中AQP4和GFAP共表达的细胞数， Western Blot法检测各组RAS中AQP4、GFAP和NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量，镜下观察DDD含药血清对RAS迁移率的影响。
统计学方法：实验所得数据均使用SPSS21.0软件进行统计学处理，计量资料以均值±标准误（?X±S）表示，所得数据均经过正态性分布检测，若符合正态分布，则采用单因素方差分析，方差齐则采用LSD法，方差不齐则采用Games-Howell法；若不符合正态分布，则采用非参检验。以P＜0.05提示差异具有统计学意义。
结果：
第一部分：自制脊髓打击器与NYU打击器建立脊髓损伤模型研究
1.各组脊髓外观形态比较
A组T10节段处硬脊膜完整，脊髓组织呈均匀乳白色，形态饱满圆润；B1、B2、C1、C2组T10节段处硬脊膜均完整，颜色呈不同程度的鲜红色或暗红色，损伤处可见水肿、瘀血及瘢痕组织增生，相对于B1、C1组， B2、C2组水肿更严重、瘀血范围更广、颜色更深、瘢痕组织更多。
2.行为学评分比较
BBB评分结果显示，A组术后除因手术致运动量减少外，未出现双下肢功能异常的表现，评分为21分；其余各组均出现不同程度的运动功能障碍，具体表现为：B2与B1、C2与C1相比，BBB评分显著降低，差异具统计学意义（P＜0.05）；B1与C1、B2与C2相比，BBB评分无显著差异（P＞0.05）。
Reuter评分结果显示，A组术后未发现感觉功能异常现象；其余各组术后均出现不同程度的感觉功能异常现象，具体表现为B2、C2组术后1d牵张反射消失，肌力、肌张力减弱或消失，疼痛回缩反射迟钝，背部感觉存在或消失；B1、C1组术后1d除肌力消失外，牵张反射、肌张力、疼痛回缩反射、背部感觉均存在，术后3d肌力开始恢复。B2与B1、C2与C1相比，Reuter评分显著降低，差异具统计学意义（P＜0.05）。B1与C1、B2与C2相比，Reuter评分无显著差异（P＞0.05）。
第二部分：抵当汤加减调节AQP4表达对SCI大鼠脊髓水肿的作用研究
1.各组脊髓组织的大体观察
从大体观察上来看，Sham组脊髓组织颜色鲜白，组织完整，未见瘀血部位和水肿；Model组在打击损伤部位可见明显的瘀血区域，瘀血颜色深红，瘀血范围较大，并可见明显脊髓水肿；DDD组在打击损伤部位可见较小的瘀血区域，瘀血部位颜色淡红，可见轻度水肿；DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组大体观察相似，肉眼见无显著差异。
2.各组脊髓组织含水率
与Sham组相比，其余各组脊髓组织含水率均显著增高（P＜0.05）；与Model组相比，DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组脊髓组织含水率均显著降低（P＜0.05）；DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较，脊髓组织含水率没有显著差异（P＞0.05）。
3.行为学观察结果
各组大鼠BBB评分、斜板实验结果以及Reuter评分显示，与Sham组相比，其余各组BBB评分和斜板实验得分均显著降低（P＜0.05），Reuter评分均显著升高（P＜0.05）；与Model组相比，DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组BBB评分均显著升高（P＜0.05），Reuter评分均显著降低（P＜0.05）；DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较无显著差异（P＞0.05）。
第三部分：抵当汤加减含药血清对反应性星形胶质细胞的活化、迁移及神经生长相关细胞因子分泌的作用
1.原代AS镜下观察
原代细胞培养2d，镜下可见AS细胞呈不规则形状散在分布，部分细胞形似星形，细胞核大、呈椭圆形，细胞胞浆丰富，从胞体向四周发出长而有分支的突起；将原代细胞传代至第三代可见细胞生长状态良好，适宜进行后续实验。
2.AS鉴定
免疫荧光染色结果显示，GFAP染色呈阳性，阴性对照组未见任何阳性染色，提示GFAP呈特异性表达，所提取的细胞为AS。
3.DDD含药血清对AS的安全干预浓度，以及干预RAS的最佳干预时间和最佳干预浓度
DDD含药血清干预AS的安全浓度范围为：0-15%，DDD含药血清干预RAS最佳的干预浓度为10%，最佳干预时间为48h。
结论：
1.自制简易脊髓打击器从20mm、40mm高处垂直撞击脊髓组织具有和NYU打击器从12.5mm、25mm处打击脊髓损伤程度相似的脊髓损伤动物模型，自制简易脊髓打击器安全性高，稳定性好，操作简便，价格低廉，可供科研工作者参考。
2.通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减可有效消除SCI大鼠损伤处水肿，促进神经功能康复。其具体的作用机制为：通过抑制AQP4的表达可抑制反应性星形胶质细胞活化，减少胶质瘢痕形成，提高神经营养因子、神经生长因子及细胞膜生长相关蛋白的表达，促进神经功能康复。
3.DDD含药血清能通过抑制AQP4的表达，有效减轻RAS水肿，减少RAS活化和减缓RAS迁移，促进RAS中神经营养因子的分泌。
本次研究结合急性脊髓损伤（acute spinal cord injury, ASCI）的研究现状和热点，基于导师的临床经验，以通过抑制水通道蛋白4（aquaporin4, AQP4）的表达从而减轻ASCI后脊髓水肿为切入点，旨在探讨通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减治疗ASCI的可能作用机制，以期为推广通腑逐瘀法治疗ASCI提供理论依据。
方法：
第一部分：10周龄SD大鼠30只，按随机数字表法随机分为假手术组（A组）、自制打击器2cm组（B1组）、自制打击器4cm组（B2组）、NYU组1.25cm组（C1组）、NYU组2.5cm组（C2组），每组各6只。除Sham组外，其余各组采用改良Allen’s法造模。B1、B2组将9g打击杆分别从2cm、4cm处自由坠落撞击T10脊髓，C1、C2组使用NYU打击器分别从1.25cm、2.5cm处撞击T10脊髓。各组造模完成后分别于1、3、5、7d进行BBB评分和Reuter评分，7d后行灌注取材，石蜡包埋切片，尼氏染色，观察各组组织受损程度和神经元存活率。
第二部分：10周龄SD大鼠60只按随机分配方法随机分为假手术组（Sham）、模型组（Model）、抵当汤组（DDD）、TGN-020组（TGN-020）和抵当汤联合TGN-020组（DDD+TGN-020），每组各12只。Sham组仅打开椎板暴露脊髓但不损伤脊髓；其余各组均采用自制脊髓打击器从40mm高度对脊髓进行打击。Sham组和Model组术后不予任何治疗措施干预，DDD组于术后3d予以抵当汤加减每日灌胃，持续3d，根据大鼠与人用药剂量体表面积换算法，DDD组大鼠每日用药剂量为5.04g/kg，采用蒸馏水进行稀释一定比例配制后予以灌胃处理，每日早晚各1次。TGN-020组处理方法：腹腔注射给药，每日用药剂量为5mg/kg，给药时间为3d。DDD+TGN-020组处理方法：予TGN-020腹腔注射给药，随后给予DDD灌胃处理。干预结束后进行行为学评价（BBB评分、斜板实验及Reuter评分）观察大鼠神经功能恢复情况，取材后进行脊髓组织大体观察和含水率检测、HE染色观察组织受损程度，尼氏染色观察神经元形态，免疫荧光检测各组脊髓组织AQP4、GFAP共表达的阳性细胞个数， Western Blot法检测各组脊髓组织中AQP4、GFAP、CSPG、PCNA、NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量，qPCR法检测各组脊髓组织中CSPG、PCNA基因的表达量，电镜下观察各组髓鞘和神经元组织形态，高尔基染色观察树突和树突棘形态。
第三部分：8周龄SD大鼠40只随机分为空白血清组和含药血清组，含药血清组给予5.04g/kgDDD灌胃，持续3d，空白血清组予等剂量超纯水灌胃，持续3d，干预结束后提取血清备用。每次取胚胎大鼠8-12只，通过机械-酶消化法提取星形胶质细胞（Astrocytes，AS），细胞采用10%的高糖培养基培养，观察细胞传代至第3代进行后续实验。首先，免疫荧光鉴定细胞中GFAP含量，随后进行实验分组：空白组（Control group， CG）、模型组（Model group，MG）、空白血清组（Blank serum group， BSG）、DDD含药血清组（DDD）、TGN-020干预组（TGN-020）、DDD联合TGN-020组（DDD+TGN-020），除MG外，其余各组均以划痕法进行造模，造模完成后DDD予以含药血清干预，BSG予以等剂量空白血清干预， TGN-020予以100nmTGN-020干预， DDD+TGN-020先予TGN-020干预后再予DDD干预。MTT法检测DDD含药血清干预AS的安全干预浓度、最佳干预时间和干预浓度，MTT法检测各组对RAS活性的影响，免疫荧光染色法检测RAS中AQP4和GFAP共表达的细胞数， Western Blot法检测各组RAS中AQP4、GFAP和NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量，镜下观察DDD含药血清对RAS迁移率的影响。
统计学方法：实验所得数据均使用SPSS21.0软件进行统计学处理，计量资料以均值±标准误（?X±S）表示，所得数据均经过正态性分布检测，若符合正态分布，则采用单因素方差分析，方差齐则采用LSD法，方差不齐则采用Games-Howell法；若不符合正态分布，则采用非参检验。以P＜0.05提示差异具有统计学意义。
结果：
第一部分：自制脊髓打击器与NYU打击器建立脊髓损伤模型研究
1.各组脊髓外观形态比较
A组T10节段处硬脊膜完整，脊髓组织呈均匀乳白色，形态饱满圆润；B1、B2、C1、C2组T10节段处硬脊膜均完整，颜色呈不同程度的鲜红色或暗红色，损伤处可见水肿、瘀血及瘢痕组织增生，相对于B1、C1组， B2、C2组水肿更严重、瘀血范围更广、颜色更深、瘢痕组织更多。
2.行为学评分比较
BBB评分结果显示，A组术后除因手术致运动量减少外，未出现双下肢功能异常的表现，评分为21分；其余各组均出现不同程度的运动功能障碍，具体表现为：B2与B1、C2与C1相比，BBB评分显著降低，差异具统计学意义（P＜0.05）；B1与C1、B2与C2相比，BBB评分无显著差异（P＞0.05）。
Reuter评分结果显示，A组术后未发现感觉功能异常现象；其余各组术后均出现不同程度的感觉功能异常现象，具体表现为B2、C2组术后1d牵张反射消失，肌力、肌张力减弱或消失，疼痛回缩反射迟钝，背部感觉存在或消失；B1、C1组术后1d除肌力消失外，牵张反射、肌张力、疼痛回缩反射、背部感觉均存在，术后3d肌力开始恢复。B2与B1、C2与C1相比，Reuter评分显著降低，差异具统计学意义（P＜0.05）。B1与C1、B2与C2相比，Reuter评分无显著差异（P＞0.05）。
第二部分：抵当汤加减调节AQP4表达对SCI大鼠脊髓水肿的作用研究
1.各组脊髓组织的大体观察
从大体观察上来看，Sham组脊髓组织颜色鲜白，组织完整，未见瘀血部位和水肿；Model组在打击损伤部位可见明显的瘀血区域，瘀血颜色深红，瘀血范围较大，并可见明显脊髓水肿；DDD组在打击损伤部位可见较小的瘀血区域，瘀血部位颜色淡红，可见轻度水肿；DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组大体观察相似，肉眼见无显著差异。
2.各组脊髓组织含水率
与Sham组相比，其余各组脊髓组织含水率均显著增高（P＜0.05）；与Model组相比，DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组脊髓组织含水率均显著降低（P＜0.05）；DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较，脊髓组织含水率没有显著差异（P＞0.05）。
3.行为学观察结果
各组大鼠BBB评分、斜板实验结果以及Reuter评分显示，与Sham组相比，其余各组BBB评分和斜板实验得分均显著降低（P＜0.05），Reuter评分均显著升高（P＜0.05）；与Model组相比，DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组BBB评分均显著升高（P＜0.05），Reuter评分均显著降低（P＜0.05）；DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较无显著差异（P＞0.05）。
第三部分：抵当汤加减含药血清对反应性星形胶质细胞的活化、迁移及神经生长相关细胞因子分泌的作用
1.原代AS镜下观察
原代细胞培养2d，镜下可见AS细胞呈不规则形状散在分布，部分细胞形似星形，细胞核大、呈椭圆形，细胞胞浆丰富，从胞体向四周发出长而有分支的突起；将原代细胞传代至第三代可见细胞生长状态良好，适宜进行后续实验。
2.AS鉴定
免疫荧光染色结果显示，GFAP染色呈阳性，阴性对照组未见任何阳性染色，提示GFAP呈特异性表达，所提取的细胞为AS。
3.DDD含药血清对AS的安全干预浓度，以及干预RAS的最佳干预时间和最佳干预浓度
DDD含药血清干预AS的安全浓度范围为：0-15%，DDD含药血清干预RAS最佳的干预浓度为10%，最佳干预时间为48h。
结论：
1.自制简易脊髓打击器从20mm、40mm高处垂直撞击脊髓组织具有和NYU打击器从12.5mm、25mm处打击脊髓损伤程度相似的脊髓损伤动物模型，自制简易脊髓打击器安全性高，稳定性好，操作简便，价格低廉，可供科研工作者参考。
2.通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减可有效消除SCI大鼠损伤处水肿，促进神经功能康复。其具体的作用机制为：通过抑制AQP4的表达可抑制反应性星形胶质细胞活化，减少胶质瘢痕形成，提高神经营养因子、神经生长因子及细胞膜生长相关蛋白的表达，促进神经功能康复。
3.DDD含药血清能通过抑制AQP4的表达，有效减轻RAS水肿，减少RAS活化和减缓RAS迁移，促进RAS中神经营养因子的分泌。