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微纳米级的铁基磁珠因其良好的生物相容性、易于修饰的表面以及超顺磁性而被认为是极佳的固相载体,被广泛应用于生物有机分析化学的研究中。将功能大分子固定于磁珠的表面,以此复合物作为配体垂钓“钓饵”,可以特异性地萃取出与该大分子发生相互作用的目标小分子,将为从复杂混合物中捕获活性小分子提供有力的手段。 DNA是遗传物质的载体,在基因的表达、转录和翻译过程中起着至关重要的作用。DNA的损伤或是异质化都会导致机体的癌变甚至是死亡,而DNA小分子结合剂具有稳定DNA免受损伤的作用。因此筛选DNA结合剂并探讨其与DNA的相互作用,将为开发治疗与DNA损伤或不稳定相关疾病的新药提供重要的参考。本学位论文首先报道的是将ds-DNA固定到磁珠上用于中药黄连中DNA结合剂的筛选。相较于传统筛选方法,此法能够更为快速、方便地从复杂成分中筛选出DNA结合剂。 酪氨酸酶(TYR)是人体内黑色素合成的关键酶,与人的衰老有密切关系,其过量表达可导致人体的色素沉积性疾病。酪氨酸酶抑制剂可以治疗目前常见的色素沉积性皮肤病如雀斑、老年斑等,同时也被用作多数美白产品的主要成分。目前从天然产物中寻找酪氨酸酶抑制剂已成为众多学者研究的焦点。本学位论文报道的另一个内容是将酪氨酸酶固定到磁珠上,利用固定化的酪氨酸酶对天然产物中的活性成分进行分析,以实现酪氨酸酶抑制剂的高效筛选。 学位论文由五章组成,具体内容如下。 第一章为固定化ds-DNA的制备和表征。首先是制备用于固定ds-DNA的氨基修饰磁珠MNPs@NH2,并通过聚合酶链式反应得到大量ds-DNA。然后,利用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺通过磷酰键直接将ds-DNA固定到MNPs@NH2表面得到MNPs@DNA。最后采用循环伏安法、微分脉冲伏安法、红外光谱、热重分析等表征方法证实了DNA成功固定到氨基修饰的磁珠上。 第二章为利用ds-DNA固定化磁珠MNPs@DNA,偶联高效液相-质谱快速、有效地对天然产物中的DNA结合剂进行固相萃取和分析。首先构建一个ds-DNA固相萃取体系,用于验证MNPs@DNA固相萃取DNA结合剂的能力。实验证明MNPs@DNA能够将DNA结合剂从体系中萃取出来。然后以黄连提取液为研究目标,利用MNPs@DNA对其中的DNA结合剂进行固相萃取。实验结果表明利用MNPs@DNA能够从黄连提取液中萃取出5个化合物,分别为非洲防己碱、药根碱、表小檗碱、掌叶防己碱和小檗碱,而这五种化合物都有相关报道证明是DNA结合剂。 第三章为固定化酪氨酸酶的制备、表征以及性质研究。首先是制备用于固定酪氨酸酶的羧基修饰磁珠MNPs@COOH,同时从马铃薯中分离纯化得到酪氨酸酶。然后利用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联剂将酪氨酸酶固定到MNPs@COOH上。采用红外光谱、热重分析、原子力显微镜等方法对合成的材料进行表征,证实酪氨酸酶成功地固定到羧基修饰的材料表面。最后对固定化酪氨酸酶的热稳定性、重复使用率、最适pH值等进行了分析。 第四章为以酪氨酸酶为靶标的天然产物有效成分筛选分析系统的构建。利用酪氨酸酶与其配体的特异性相互作用,将能够与酪氨酸酶结合的有效成分筛选出来,并利用高效液相色谱-质谱技术对筛选出来的有效成分进行鉴定。本章以夏枯草提取液为研究对象,利用酪氨酸酶固定化磁珠对其有效成分进行筛选。经过分析鉴定,筛选分离出来的化合物为咖啡酸和迷迭香酸。经体外酶活实验证实咖啡酸具有酪氨酸酶激活作用,而迷迭香酸具有酪氨酸酶抑制作用。 第五章为固定化DNA和固定化酶的研究进展。