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背景与目的急性草酸盐肾病,可由各种原因所导致的高草酸尿症所引起。尿液中钙离子与草酸根离子的过饱和是导致晶体形成的重要机制。临床上原发性高草酸尿症较为罕见,因此常见的以继发性为主。难溶性的草酸钙晶体沉积于肾小管、间质中,阻塞肾小管腔,从而引起肾小管上皮细胞损伤、刷状缘脱落、肾小管管腔扩张以及蛋白质管型等一系列急性肾小管损伤病理现象。目前对于该疾病仍然处于对症治疗阶段,但已发生的肾功能损伤却难以完全修复,有甚者发展为慢性肾损伤及终末期肾病。因此,亟需探索其明确的发病机制以治疗急性草酸盐肾病。前列腺素E2(PGE2),作为花生四烯酸的代谢产物之一,通过作用于下游的前列腺素E2受体(EPs,属于G蛋白偶联受体;包括4个亚型,即EP1、EP2、EP3以及EP4),在肾脏疾病的发生发展中起到重要作用。传统观点认为,PGE2是介导炎症性疾病的主要物质之一,通过下游不同受体发挥不同的炎症反应。结合本实验室早期的工作,我们认为PGE2-EP3信号通路在调节炎症方面具有重要意义。此外,肾实质细胞EP3还参与肾脏的水、盐代谢,对于尿液的成分构成有着重要作用。然而,目前对于EP3如何影响急性草酸盐肾病的进展尚不清楚。因此,本研究拟通过干预Ep3基因表达来探索EP3对于小鼠急性草酸盐肾病的影响以及潜在机制。材料与方法本实验均采用8-12周龄、体重为22-25 g左右的雄性小鼠进行研究。前期主要采用在EP3外显子1序列插入两个loxP位点的小鼠(Ep3F/F小鼠)以及髓系细胞条件性敲除Ep3小鼠(Ep3F/F;Lyz2cre小鼠),通过腹腔注射1%草酸钠溶液(剂量为100 mg/kg),同时给与小鼠3%草酸钠溶液饮用水的方法构建小鼠急性草酸盐肾病模型,对照组采用生理盐水代替(即:(1)Ep3F/F对照组;(2)Ep3F/F草酸钠组;(3)Ep3F/F;Lyz2cre对照组;(4)Ep3F/F;Lyz2cre草酸钠组)。于24小时后观察、取材。检测小鼠血清肌酐、尿素氮以及肾小管损伤得分等肾损伤指标。采用免疫荧光方法检测肾组织中性粒细胞浸润情况。采用实时荧光定量PCR的方法检测肾组织单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA的表达水平。蛋白质免疫印迹法检测多种细胞死亡通路标志性蛋白。采用TUNEL试剂盒检测肾脏组织凋亡情况。酶联免疫吸附试验检测血清高迁移率族蛋白族B1(HMGB1)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)的水平。后期研究主要采用C57BL/6N野生型(WT)小鼠以及同背景下的全身Ep3基因敲除小鼠(Ep3-/-小鼠),同样按上述方式构造模型(即:(1)WT对照组;(2)WT草酸钠组;(3)Ep3-/-对照组;(4)Ep3-/-草酸钠组)。于24小时后观察、取材。检测小鼠血清肌酐、尿素氮以及评估肾小管损伤得分等肾损伤指标;蛋白质免疫印迹法检测肾组织PGE2上游信号通路蛋白表达水平;最后检测小鼠尿量以及尿液草酸根离子含量。结果1、与Ep3F/F对照组相比,Ep3F/F草酸钠组小鼠血清肌酐、尿素氮以及肾小管损伤得分均升高(P<0.01);相较于Ep3F/F草酸钠组小鼠,Ep3F/F;Lyz2cre草酸钠组小鼠血清肌酐、尿素氮以及肾小管损伤得分显著降低(P<0.01)。2、与Ep3F/F对照组相比,Ep3F/F草酸钠组小鼠肾组织中性粒细胞浸润水平以及MCP-1 mRNA水平显著升高(P<0.01);相较于Ep3F/F草酸钠组小鼠,Ep3F/F;Lyz2cre草酸钠组小鼠肾组织中性粒细胞浸润水平显著下降(P<0.01),同时MCP-1 mRNA水平也下降(P<0.05)。3、与Ep3F/F对照组相比,Ep3F/F草酸钠组小鼠肾组织TUNEL染色阳性细胞数目显著升高(P<0.01);相较于Ep3F/F草酸钠组,Ep3F/F;Lyz2cre草酸钠组小鼠肾组织TUNEL染色阳性细胞数目下降(P<0.05)。4、蛋白质免疫印迹结果显示,与WT对照组相比,WT草酸组小鼠肾组织PGE2合成相关蛋白酶表达均上调;相较于Ep3F/F草酸钠组小鼠,Ep3F/F;Lyz2cre草酸钠组小鼠肾组织凋亡、坏死性凋亡、焦亡以及铁死亡等相关蛋白表达下降(P<0.05)。5、酶联免疫吸附试验结果显示,与Ep3F/F对照组相比,Ep3F/F草酸钠组小鼠血清HMGB1、S100A8水平显著升高(P<0.01);相较于Ep3F/F草酸钠组,Ep3F/F;Lyz2cre草酸钠组小鼠血清HMGB1、S100A8水平下降(P<0.05)。6、与WT对照组相比,WT草酸钠组小鼠血清肌酐、尿素氮以及肾小管损伤得分均显著升高(P<0.01);WT草酸钠组小鼠与Ep3-/-草酸钠组小鼠的肌酐、尿素氮以及肾小管损伤得分无差异(P>0.05)。7、相较于WT草酸钠组小鼠,Ep3-/-草酸钠组小鼠24小时尿量以及尿液草酸含量均下降(P<0.01),与对照组无统计学差异(P>0.05)。结论1、髓系细胞条件性敲除Ep3基因,通过减少炎症细胞浸润的方式,抑制肾组织细胞死亡以及HMGB1、S100A8的释放,阻断坏死性炎症的“自我放大”效应,从而有效改善小鼠急性草酸盐肾病。2、全身Ep3基因敲除在抑制炎症的同时阻止了尿液及草酸根离子的排出,整体上不能改善小鼠急性草酸盐肾病。