论文部分内容阅读
[目的]优化提取方法,分离活化高质量、高增殖率的Treg细胞。证实Treg细胞除了通过直接接触抑制CD8+T细胞增殖外,也可以通过非接触方式抑制CD8+T细胞增殖。证实Treg细胞对CD8+T的抑制是可以通过exosomes实现的。Treg及其 exosomes 可通过 microRNA-194-1-3p 靶向 LAT1(Slc7a5)调控 mTOR 信号传导通路,影响氨基酸的转运,从而抑制CD8+T细胞增殖。建立SD大鼠供体,Wistar大鼠异体原位肝移植模型,通过动物体内实验证实Treg-exosomes对同种异体肝移植的保护作用。[方法]1、Treg细胞对CD8+T细胞功能和增殖影响:取BALB/C小鼠脾脏,分别采用磁珠吸附分选和流式分选Treg细胞。分离得到的Treg细胞通过CD3、CD28、IL-2单克隆抗体以及Rapamycin共同活化并扩增。CD8+T细胞采用磁珠吸附分选,通过CD3、IL-2单克隆抗体活化CD8+T细胞。采用Transwell系统及直接共培养Treg细胞和CD8+T细胞。采用CCK-8检测不同时间点CD8+T细胞增殖情况,以及通过PI染色分析CD8+T细胞细胞周期变化情况。2、Treg-exosomes对CD8+T细胞功能和增殖影响:收集Treg细胞上清液,分别采用exosomes提取试剂盒和超高速差速离心法两种方法提取exosomes,并通过western blot检测CD63表达,确定不同培养时间Treg细胞上清液不同提取方法中exosomes的含量。通过电镜分析以及粒径分析和western blot检测CD63、LAPMP-1蛋白表达三方法,共同鉴定提取的exosomes。构建绿色荧光蛋白(GFP)标记的CD63慢病毒,感染Treg细胞,并在荧光显微镜检测感染效率,提取带荧光的Treg-exosomes感染活化的CD8+T细胞,共聚焦荧光显微镜检测感染效率。按照下面分组进行干预细胞:a对照组:正常培养的CD8+T细胞;b共培养组:Treg细胞和CD8+T细胞组;c高剂量exosomes组:在CD8+T细胞中加入40ug Treg细胞来源的exosomes;d低剂量exosomes组:在CD8+T细胞中加入10ug Treg细胞来源的exosomes;e抑制剂Treg组:活化Treg细胞加入GW48692小时后与CD8+T细胞共培养;f抑制剂exosomes组:在CD8+T细胞中加入40ug Treg细胞来源的exosomes的同时加入GW4869。采用CCK-8检测不同时间点上面6组CD8+T细胞增殖情况及细胞周期变化情况,同时通过QPCR、Western blotting、流式细胞术检测CD8+T细胞分泌细胞因子IFNλ和Perforin的表达情况。3、Treg 细胞及其 exosomes 可通过 microRNA-194-1-3p靶向LAT1(Slc7a5)调控mTOR信号通路:收集Treg细胞和exosomes干预后CD8+T细胞,使用microRNA芯片检测筛选差异microRNA,并进行QPCR验证、靶基因预测、靶基因GO和KEGG分析。生物信息学预测网站预测microRNA-194-1-3p与LAT1(Slc7a5)的靶向关系,并通过双荧光素酶报告基因实验证实。mumics和inhibitor转染CD8+T细胞,QPCR检测mmu-miR-194-1-3p和Slc7a5基因的变化情况,mmu-miR-194-1-3p mimics 和 inhibitor 干预 CD8+T 细胞检测 CD8+T 细胞增殖情况。通过 western blot 检测 mmu-miR-194-1-3p的mimics 和 inhibitor 干预 CD8+T细胞后靶基因Slc7a5和p-mTOR蛋白表达情况。4、Treg-exosomes对同种异体肝移植保护作用:本实验通过Kamada“二袖套”法,建立Wistar大鼠异体原位肝移植模型,分为A、B两组,术后第4天开始均给予雷帕霉素,A组在第1、3、5天注射Treg细胞中提取的exosomes。术后3day、11day、18day尾静脉取血浆检查ALT、TBIL水平,同时观察存活时间。[结果]1、Treg细胞对CD8+T细胞功能和增殖抑制作用:流式细胞术鉴定流式分选和磁珠吸附分选Treg细胞CD4+CD25+Treg阳性比率分别为93.2%和87%,CD8+T细胞磁珠吸附分选阳性比率为91.44%。Treg细胞与CD8+T细胞共培养后CCK-8检测结果显示,无论是Transwell系统共培养还是直接共培养,CD8+T细胞增殖都显著下降(均P<0.05)。共培养后增殖周期检测结果显示,GO/G1期的CD8+T细比例显著增加,S期和G2/M期都表现出更少的富集细胞。2、Treg-exosomes对CD8+T细胞功能和增殖抑制作用:(1)Western Blot检测结果显示,聚合沉淀法提取的exosomes CD63表达明显高于超速离心法。透射电镜下观察exosomes是圆形或类圆形的,直径分布在30-150nm的范围内。Western Blot检测结果显示exosomes中CD63、LAPMP-1蛋白均呈阳性表达。荧光显微镜观察慢病毒感染Treg细胞,48h后显示荧光表达含量达到70%以上。共聚焦荧光显微镜可以观察到Treg-exosomes感染了 CD8+T细胞。(2)Treg-exosomes与CD8+T细胞共培养后,CCK-8检测CD8+T细胞增殖情况显示:Treg-exosomes与活化CD8+T细胞共培养后,CD8+T细胞的增殖明显降低,而且在高剂量exosomes组中抑制作用更为明显。而预先在Treg中加入了 GW4869抑制exosomes的分泌,结果显示Treg细胞对CD8+T细胞的抑制作用减弱了。流式细胞仪检测CD8+T细胞周期情况得到了相似的结果。(3)QPCR、Western blotting和流式细胞术检测perforin、IFN-γ。结果显示,Treg细胞以及高剂量exosomes干预CD8+T细胞后IFN-γ和Perforin蛋白表达明显下调(均P<0.05),相比之下,Treg细胞加入GW4869后IFN-y和Perforin蛋白表达无明显变化。3、Treg 细胞及其 exosomes 通过 microRNA-194-1-3p靶向LAT1(S1c7a5)调控mTOR信号通路:基因芯片及QPCR验证Treg细胞及exosomes一致变化的有13个microRNA。双荧光素酶报告基因实验证实,mmu-miR-194-1-3p与S1c7a5基因3’-UTR靶向结合。细胞转染构建高表达miR-194-1-3p和低表达miR-194-1-3p的细胞株检测mRNA和蛋白水平表达的变化,结果提示miR-194-1-3p与Slc7a5、p-mTOR在CD8+T细胞中的表达呈直接负相关。高表达miR-194-1-3p可以显著抑制CD8+T细胞的增殖,G0/G1、G2/M期表现细胞显著增加而S期表现细胞显著减少。4、Treg-exosomes对同种异体肝移植保护作用:术后第3天时A组的ALT、TBIL水平较B组的低,但差别不大,第11天时两组的ALT、TBIL水平均有降低,但A组更为明显,两组之间有显著差异(P<0.05)。到第18天时两组的ALT、TBIL水平继续有降低,但仍然是A组降低更为明显(P<0.05),两组之间有显著差异。注射Treg-exosomes大鼠存活时间明显延长。对照组(B组)在移植后有28天的中位存活时间,而Treg-exosomes治疗组(A组)的存活时间明显更长,达到90天。[结论]1、通过磁珠吸附分选得到的Treg细胞,在CD3/CD28单抗、雷帕霉素、IL-2刺激培养下,可以良好增殖。Treg细胞对CD8+T细胞的增殖具有明显抑制作用,Treg细胞对CD8+T细胞既可以通过细胞间直接接触,也可以通过非直接接触的方式抑制CD8+T细胞增殖。2、通过ExoQuick precipitation法可以提取到更多的Treg细胞exosomes,同时显示Treg细胞培养72h收集上清得到的exosomes量更多。Treg细胞可以被pCT-CD63-GFP慢病毒转染且标记其分泌的exosomes,并可以直观地观察到Treg分泌的exosomes转移并整合到CD8+T细胞内。Treg细胞可以通过分泌exosomes影响CD8+T细胞的细胞周期分布,抑制CD8+T细胞增殖,以及抑制其分泌穿孔素以及IFN-γ。3、Treg细胞及其分泌的exosomes可以通过miR-194-1-3p发挥其对CD8+T细胞的抑制作用。miR-194-1-3p可能通过靶向下调LAT1(Slc7a5)抑制mTOR信号传导通路,影响氨基酸的转运,从而抑制CD8+T细胞增殖。4、同种异体肝移植大鼠注射Treg细胞来源的exosomes后同,移植大鼠存活时间明显延长。Treg-exosomes在大鼠体内发挥免疫抑制作用需要一定的反应时间,且随着时间的推移有进一步扩大的趋势。