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重组腺病毒相关病毒载体(recombinant adeno-associated virus,rAAV)具有无致病性、免疫原性低、安全性好、能感染种类众多的组织细胞、可介导外源基因长期表达等特点,是一种比较理想的基因治疗载体。但实践表明,AAV载体对各种组织的广泛嗜性对于基因转移(尤其是系统性给药的基因转移)而言是不利的,因为进入体内的重组AAV载体可能被各种各样的组织所捕获,并将其基因组转导并整合入非预期的组织和细胞中。因而人们设想,若能够发展可特异转导目标组织的靶向性AAV载体,则可以显著提高基因转移的效率和安全性,减少重组AAV载体病毒的用量,除此以外,这种靶向性AAV载体还可以转导原本非允许的组织细胞,从而扩大了AAV载体的应用范围。
在本研究中,我们的目的是将能与抗体Fc段特异结合的金黄色葡萄球菌蛋白A的截短的Z结构域多肽(命名为Z34C,由34个氨基酸组成)插入到AAV2衣壳蛋白的587位点,包装产生衣壳突变AAV2病毒载体,Z34C多肽能够呈现在突变病毒的表面,与抗体孵育后,突变病毒就能够特异转导抗体所识别的目标细胞。
为了达到以上目的,我们将AAV2的cap基因亚克隆于pUC-18载体上,然后采用引物带入定点插入突变的方法,将编码Z34C多肽的102bp的核苷酸序列插入到cap基因的特定位点(对应于氨基酸587位),再将突变的cap基因替换正常的cap基因,然后将AAV2的rep基因和突变了的cap基因整合到I型单纯疱疹病毒(HSVl)的基因组中,从而产生携带了rep基因和突变了的cap基因的重组HSVl病毒,这种重组HSVl病毒感染细胞后,不仅可以表达产生衣壳突变AAV2载体复制和包装所必需的非结构蛋白(Rep蛋白)和结构蛋白(含Z34C多肽的突变衣壳蛋白:VP1、VP2、VP3),而且可以提供AAV2载体包装所需的辅助功能,也即此重组HSVl病毒兼有传统包装系统中的辅助病毒与助手质粒的功能。用此重组HSV病毒感染含有AAV2载体质粒成分的载体细胞株,就能够把载体成分(外源基因表达框及其两侧的ITR)从载体细胞株的染色体上拯救出来并进行复制,最后包装成衣壳突变的重组AAV2载体病毒。
在国内外的类似研究中,一般采用传统的质粒共转染的方法来制备这种突变病毒,发现其包装效率明显下降,每个细胞的产量在仅在10<2>v.g左右。在本研究中,我们采用一种新的包装策略也即“一种辅助病毒感染一个载体细胞株”的策略<[57]>来制备突变病毒,获得了较为理想的包装效率,10<9>个生产细胞的产量达到了4×10<13>v.g的重组AAV2载体病毒,每个细胞可以产生4×10<4>左右的病毒粒子。
经过初步纯化和柱纯化后,获得了高纯度且活性较好的衣壳突变重组AAV2载体(AAV2/Z34C-GFP和AAV2/Z34C-Luc)。用AAV2/Z34C-Luc进行的功能实验表明:1:AAV2/Z34C-Luc能够与抗体的Fc段结合,而且能够通过抗体介导特异地吸附在目标细胞的表面。2、在没有抗体介导的情况下,AAV2/Z34C-Luc对BHK细胞的转导效率较AAV2-Luc低大约10倍左右。3、与不同浓度的单抗Herceptin孵育后,AAV2/Z34C-Luc对Her2阳性细胞SK-BR-3的转导效率显著增强,在Herceptin的一定浓度范围内,增强程度随着Herceptin浓度的升高而提高,而且其转导途径不再依赖于其主受体HSPG,肝素不能够阻断这种抗体介导的转导增强作用。4、用蛋白A与AAV2/Z34C-Luc共孵育后再与抗体孵育,发现蛋白A能够竞争性抑制抗体介导的转导增强作用,说明蛋白A能够与AAV2/Z34C-Luc竞争抗体的Fc段,从而抑制抗体与AAV2/Z34C-Luc的结合。5、无关单抗不能增强AAV2/Z34C-Luc对目标细胞的转导。以上结果表明AAV2/Z34C-Luc的表面呈现了Z34C多肽,而且此多肽具有较强的与抗体Fc段结合的能力。将突变载体病毒与抗体孵育后,结合了抗体的突变载体病毒能够通过抗体对目标细胞表面分子的识别作用而吸附到细胞表面,并进而转导细胞,从而实现了抗体介导的靶向性感染。
通过本论文工作,我们建立了一套在AAV2衣壳的不同位点进行突变并且高效制备衣壳突变AAV2载体病毒的方法,并证实在衣壳蛋白氨基酸587位插入了Z34C多肽的衣壳突变AAV2载体病毒具有抗体介导的靶向性转导的特性,为以后直接在衣壳中插入各种靶向肽,并制备足够量的针对各种目标组织的靶向性AAV载体以用于体内外实验打下了良好的基础。