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目的LncRNAZEB1-AS1是一种跟肿瘤进展密切相关的LncRNA,但目前针对LncRNAZEB1-AS1在结直肠癌（CRC）的作用研究仍比较少,以及其调控机制有待进一步深入研究。本研究旨在通过生物信息学、临床样本研究LncRNAZEB1-AS1与结直肠癌临床特征、免疫微环境的关系;同时,进一步明确LncRNAZEB1-AS1对结直肠癌增殖和迁移的影响及其具体的分子机制;最后,通过m6A修饰的角度阐明LncRNAZEB1-AS1在结直肠癌中异常表达的原因。方法1.通过TCGA数据库收集结直肠癌和癌旁正常组织的测序数据集,通过分析LncRNAZEB1-AS1在结直肠癌中的表达水平,并通过Kaplan-Meier曲线分析LncRNAZEB1-AS1对预后的影响,使用基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）研究ZEB1-AS1的潜在调控途径。通过筛选对结直肠癌预后的风险基因,采用LASSO Cox模型中构建其临床预后模型,并通过建立和测试预测列线模图构建临床预后预测模型。最后使用功能富集分析预测以LncRNAZEB1-AS1为风险评分的免疫治疗反应。2.通过实验研究进一步验证生物信息学结果,收集80例新鲜的CRC组织和配对的癌旁正常结肠组织,采用RT-q PCR检测患者肿瘤和癌旁正常组织LncRNAZEB1-AS1的表达水平,分析LncRNAZEB1-AS1表达与临床特征和预后的关系。采用Lovo和HT29细胞敲低LncRNAZEB1-AS1的表达,CCK8、克隆形成、Transwell侵袭和迁移实验评估LncRNAZEB1-AS1对结直肠癌增殖迁移的影响,进一步分析LncRNAZEB1-AS1的潜在调控靶点和mi RNA。研究结果发现lncRNAZEB1-AS1与YAP1具有显著的相关性,本研究采用Star Base网站预测了lncRNAZEB1-AS1的潜在吸附的mi RNAs,通过数据库找lncRNAZEB1-AS1互作的mi RNA,同时与YAP1的互作mi RNA取交集,选择其中评分最高的为mi R-5590-3p,通过荧光素酶报告试验、表型挽救实验等验证LncRNAZEB1-AS1通过mi R-5590-3p调控结直肠癌YAP1的表达,促进结直肠癌的增殖和转移。最后采用裸鼠成瘤模型、肠癌原位肝转移模型评估LncRNAZEB1-AS1敲低后对肿瘤增殖、转移的影响。3.采用SRAMP在线软件预测LncRNAZEB1-AS1潜在的m6A修饰位点;采用GEPIA分析LncRNAZEB1-AS1与m6A修饰相关因子的相关性,其中LncRNAZEB1-AS1与YTHDC1表达相关性高,免疫组化检测YTHDC1在结直肠癌中的表达与临床特征的关系,并分析YTHDC1表达与LncRNAZEB1-AS1的相关性。RNA干扰敲低HT29和Lovo细胞LncRNAZEB1-AS1的表达,采用m6A RNA免疫沉淀（Me RIP）YTHDC1,Me RIP-q PCR检测LncRNAZEB1-AS1的RNA m6A修饰水平,RNA半衰期试验测定敲低YTHDC1后对LncRNAZEB1-AS1的m RNA稳定性的调控。最后,对LncRNAZEB1-AS1关键的m6A修饰位点进行点突变后,荧光素酶报告实验验证LncRNAZEB1-AS1具体的m6A修饰位点。结果1.TCGA数据库结直肠癌组织中,LncRNAZEB1-AS1表达显著上调,且LncRNAZEB1-AS1高表达与患者预后不良相关。单变量和多变量Cox回归分析结果显示,LncRNAZEB1-AS1可作为结直肠癌治疗的独立预后因素（P＜0.05）。通过GESA分析提示LncRNAZEB1-AS1与白细胞介素-8的产生、细胞衰老的正调节、组织重塑的正调节、血管内皮生长因子的产生以及趋化因子受体结合相关。对LncRNAZEB1-AS1共表达的基因（METTL14,VIRMA,EIF5B,NUDT3,KIFC1,TPT1,CIITA）构建临床预后模型风险评分,ROC分析发现Risk score在训练集预测预后的准确性为:1年AUC=0.650,3年AUC=0.706,5年AUC=0.706;其中高风险评分患者其B细胞、巨噬细胞和Tfh细胞浸润水平较高,高风险评分患者对免疫治疗的反应低于低风险评分患者。2.LncRNAZEB1-AS1在CRC的表达水平较癌旁正常组织显著增高,其中lncRNAZEB1-AS1高表达与CRC的肿瘤大小（≥5cm）及更高的TNM分期（Ⅲ/Ⅳ期）密切相关（P＜0.05）,而lncRNAZEB1-AS1表达水平与CRC患者的年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤位置、淋巴血管侵袭情况、MSI/MMR状态没有显著的相关性（P＞0.05）。高表达lncRNAZEB1-AS1的结直肠癌患者与总体生存率不良显著相关（Log-rank test=5.665,P=0.0173）。3.敲低了Lovo和HT-29细胞的lncRNAZEB1-AS1表达,结直肠癌细胞的生长活力和克隆形成能力显著低于对照组,细胞侵袭和迁移能力显著下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Lovo和HT29细胞敲低ZEB1-AS1表达后,western-blot检测发现YAP1,CTGF,AREG,vimentin,Snail,Slug,和Twist的表达水平均下降,而E-cadherin的表达水平上调;lncRNAZEB1-AS1表达与YAP1、CTGF、VIM、SNAIl、SNAI2、Twist的m RNA水平呈显著的正相关。4.lncRNAZEB1-AS1的3’端与mi R-5590-3p的5’端存在相互匹配的结合位点,且mi R-5590-3p与YAP1的3’端存在相互匹配的结合位点。转染mi R-5590-3p模拟物可以显著抑制ZEB1-AS1报告基因的荧光素酶活性,转染mi R-5590-3p模拟物可以显著抑制YAP1报告基因的荧光素酶活性;结直肠癌组织中,lncRNAZEB1-AS1与mi R-5590-3p的表达存在显著的负相关（r=-0.427,P＜0.05）;YAP1与mi R-5590-3p的表达存在显著的负相关（r=-0.472,P＜0.05）,lncRNAZEB1-AS1与YAP1存在显著的正相关（r=0.425,P＜0.05）。Lovo和HT29肠癌细胞敲低lncRNAZEB1-AS1后,可以下调YAP1的表达,同时采用mi RNA inhibitor抑制mi R-5590-3p表达后,可以恢复YAP1的表达水平;过表达lncRNAZEB1-AS1后可增加Lovo和HT29细胞的增殖、迁移能力,而同时敲低YAP1的表达后则可下降Lovo和HT29细胞的增殖、迁移能力。5.lncRNAZEB1-AS1敲低的Lovo细胞移植瘤模型其肿瘤生长能力显著低于对照组（P＜0.05）。同时,采用lncRNAZEB1-AS1敲低的Lovo细胞接种于BALB/c裸鼠盲肠部,敲低Lovo细胞的lncRNAZEB1-AS1后小鼠盲肠原位肿瘤模型的生存时间显著延长（图19C）,且结直肠癌肝转移性结节数量显著低于对照组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。6.GPEIA数据库分析结直肠癌中LncRNAZEB1-AS1与Writers和Readers的m RNA表达的相关性,结直肠癌中LncRNAZEB1-AS1与METTL14（R=0.27,P＜0.001）和YTHDC1（R=0.35,P＜0.001）表达呈显著的正相关;YTHDC1在结直肠癌中高表达与更大的肿瘤大小（≥5cm）、和更晚的临床分期（Ⅲ/Ⅳ）密切相关（P＜0.05）。敲低YTHDC1后,细胞用放线菌素处理,Lovo和HT29细胞中的LncRNAZEB1-AS1 m RNA在6、9小时的相对表达水平显著低于对照组;YTHDC1可以在Lovo和HT29细胞中直接结合LncRNAZEB1-AS1;敲低METTL3/METTL14后,YTHDC1在Lovo和HT29细胞中直接结合LncRNAZEB1-AS1明显减少;荧光素酶报告基因系统验证,敲低METTL3/METTL14对ZEB1-AS1的第427位的腺嘌呤碱基确实存在m6A修饰。结论1.结直肠癌高表达lncRNAZEB1-AS1,lncRNAZEB1-AS1是结直肠癌肿瘤进展、预后及调控肿瘤免疫微环境的重要标记物。2.靶向lncRNAZEB1-AS1可以抑制结直肠癌的增殖和转移。3.LncRNAZEB1-AS1通过mi R-5590-3p调控结直肠癌YAP1的表达,促进结直肠癌的增殖和转移。4.YTHDC1通过m6A修饰促进在结直肠癌中lncRNAZEB1-AS1的m RNA表达的稳定性,促进结直肠癌侵袭转移。