喹嗯啉类药物(Quinoxalines)是具有喹嗯啉-1,4-二氧化物基本结构的,促进动物生长的广谱抗菌促生长动物专用药,主要包括卡巴氧(Carbadox, CBX)、喹乙醇(Olaquindox, OLA)、喹赛多(Cyadox, CYA)、喹烯酮(Quinocetone, QCT)和乙酰甲喹(Mequindox, MEQ)等五种药物。有研究证实喹噁啉类药物中大多数药物都发现对动物机体的肾上腺有毒性影响,如卡巴氧、喹乙醇、喹赛多持续给药能够导致猪肾上腺毒性,抑制猪体内醛固酮合成,引起水盐代谢失衡。在进一步研究中也证实了卡巴氧及其代谢物能够不可逆的抑制肾上腺皮质酮向醛固酮的转化,可减少醛固酮的分泌。中毒剂量的喹乙醇能够对鸡肾上腺皮质功能产生抑制性损害,使血浆中醛固酮含量减少,,导致低血钠和高血钾,肝微粒体酶系统被抑制,细胞色素P-450酶含量减少,肾排泄功能受损。在长期喂养动物试验中也发现高剂量乙酰甲喹能够导致大鼠肾上腺组织损伤,使血浆皮质酮、醛固酮下降即甾类激素释放失衡及引起水盐代谢紊乱,并引起细胞色素P450酶CYP11B1和醛固酮合成酶CYP11B2下调；在猪离体肾上腺细胞水平上,观察到该类药物能够减少猪肾上腺皮质细胞醛固酮的分泌。本实验室前期研究中也发现喹烯酮对猪离体的肾上腺皮质细胞有毒性损伤,且抑制醛固酮合成及分泌相关酶的表达。有研究表明喹噁啉类药物潜在毒性作用可能与体内的脱氧代谢物有关,因此,对喹噁啉类药物在动物体内代谢物的毒性研究具有重要的意义。本研究主要以人肾上腺皮质细胞NCI-H295R作为离体细胞模型,通过加入喹噁啉类的脱氧代谢物,筛选主要的毒性代谢物,通过醛固酮合成主要酶的调控表达影响对其毒性作用机制进行更深一步的研究探讨。研究结果发现,喹噁啉类代谢物对肾上腺细胞具有时间剂量依赖性的毒性,通过对醛固酮激素水平的检测,确定喹噁啉类药物脱氧代谢物的主要毒性代谢物为N1脱氧代谢物,其毒性大小依次为N1脱氧喹烯酮>N1脱氧乙酰甲喹>N1脱氧喹赛多,与喹噁啉类原形药物的毒性大小顺序一致,其毒性代谢物的筛选与其侧链化学式的结构具有一定关系,从而引起肾上腺细胞的毒性损伤。我们也首次发现N1脱氧喹烯酮、N1脱氧乙酰甲喹、N1脱氧喹赛多对肾上腺细胞的毒性损伤与氧化应激密切相关,导致机体脂质过氧化,最终导致细胞氧化还原体系的失衡；不同药物对氧化应激指标的影响能力不同,其氧化损伤程度与其对醛固酮激素的毒性抑制呈正相关。药物作用引起醛固酮合成分泌的抑制,天然氧化应激抑制剂原花青素能够有效提高醛固酮的合成分泌,减缓药物对肾上腺细胞的毒性损伤,减轻药物对细胞的脂质过氧化,减缓药物引起的氧化损伤。喹烯酮主要的毒性代谢物N1脱氧喹烯酮能极显著的抑制转录因子NURR1及ATF-1基因表达水平,以及有效的抑制NGFIB的表达,调控醛固酮合酶CYP11B2基因的表达水平；通过抑制转录因子CREB、SF-1的表达,从而抑制CYP11B1蛋白及基因的表达。N1脱氧喹烯酮通过对转录因子不同的调控能力,从而决定各转录因子与目的基因启动子位点结合能力的强弱,抑制所有转录因子的表达,引起醛固酮合成主要酶CYP11B、CYP11B2基因和蛋白的表达表达水平的下降,能够显著下调CYP11B2的基因水平,抑制CYP11B1基因的表达,最终导致醛固酮激素分泌的降低。加入氧化应激抑制剂原花青素后,原花青素能显著上调转录因子CREB的表达,以及上调表达转录因子NURR1、NGFIB、ATF-1,提高转录因子与启动子的结合,促进CYP11B1、CYP11B2的转录与表达,提高CYP11B1、CYP11B2基因和蛋白水平的表达,缓解药物对肾上腺细胞的毒性反应,升高醛固酮激素的分泌水平。N1脱氧乙酰甲喹作为乙酰甲喹主要的毒性代谢物,能抑制NCI-H295R细胞醛固酮激素的分泌。一方面,通过抑制CREB及SF-1基因的表达,其中显著抑制SF-1的表达,调控抑制CYP11B1基因及蛋白的表达；另一方面,N1脱氧乙酰甲喹作用于细胞后,极显著的抑制转录因子NURR1、NGFIB、ATF-1基因表达,使得各个转录因子不能与CYP11B2基因启动子上的结合位点充分结合,抑制CYP11B2的表达,进一步使得醛固酮合酶的表达抑制,最终抑制醛固酮激素的合成分泌。原花青素对转录因子NGFIB作用效果不显著,能够显著上调转录因子NURR1、ATF-1基因的表达,从而有效的促进转录因子与启动子结合位点的结合,促进CYP11B2基因的表达；另一方面原花青素能够诱导SF-1的表达,而对CREB诱导效果不显著,促进转录因子与CYP11B1的结合,进而促进CYP11B1基因的上调表达。最终缓解N1脱氧乙酰甲喹对NCI-H295R细胞的毒性作用,促进醛固酮激素的合成分泌。N1脱氧喹赛多作为喹赛多主要的毒性代谢物,毒性小于其他喹噁啉类药物代谢产物,在低剂量下对肾上腺细胞没有毒性影响,随着药物剂量加大及药物作用时间延长条件下,可引起肾上腺细胞醛固酮激素分泌的下降。转录因子CREB、SF-1能够在药物作用下,基因水平显著下调,从而使得转录因子与CYP11B1结合位点结合能力下降,抑制CYP11B1基因及蛋白的表达；另外一方面,转录因子NURR1、 NGFIB、ATF-1在N1脱氧喹赛多作用下,基因表达受到抑制,不能与CYP11B2基因上启动子位点充分结合,从而抑制CYP11B2的转录表达；因此,N1脱氧喹赛多主要通过抑制CYP11B1及CYP11B2基因和蛋白的表达,共同调控醛固酮的合成与分泌,从而引起肾上腺细胞醛固酮激素分泌量的下降。原花青素通过诱导转录因子CREB及SF-1的表达,从而上调CYP11B1基因和蛋白的表达,在短时间药物作用下,促进作用显著,药物孵育时间延长后,原花青素对转录因子及目的基因的诱导调控能力减弱；转录因子NGFIB、NURR1在原花青素的诱导作用下,能够显著上调表达水平,加强转录因子与CYP11B2启动子位点的结合能力,进一步促进CYP11B2的表达,缓解高剂量N1脱氧喹赛多对肾上腺皮质醛固酮的毒性反应。喹嗯啉类药物的N1脱氧代谢物通过对不同转录因子不同的抑制调控能力,调节转录因子与目的基因CYP11B1、CYP11B2的结合能力,从而使得目的基因及蛋白在调控促进合成醛固酮过程中受到抑制,使醛固酮合成受限,进一步引起醛固酮激素的显著下降和细胞的毒性损伤。原花青素也通过对转录因子及醛固酮合成主要酶的基因表达不同的诱导调控能力,引起醛固酮激素量不同程度的上升,减缓药物的毒性,从而达到缓解毒性的作用。