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本论文主要应用溶液核磁共振方法研究金黄色葡萄球菌核酸酶E43S突变体与DNA的相互作用以及金黄色葡萄球菌核酸酶1-110片段的折叠特性。第一章综述部分详细介绍了15N核磁共振弛豫研究蛋白质主链动力学方面的进展。第二章和第三章报告了论文的研究结果。
1.金黄色葡萄球菌核酸酶E43S突变体与DNA作用的核磁共振研究。
构建并表达了核酸酶的E43S突变体,据文献报道这个突变体酶活力下降明显,但与底物的结合力变化不大。通过优化影响蛋白-DNA结合的各种因素(pH值、盐浓度、金属离子种类、温度等)获得了适合NMR研究的稳定的样品条件。酶活实验、分子排阻色谱、一维1H谱、1H-15NHSQC、核磁共振扩散实验以及分子整体旋转扩散分析均表明[EA3S]SNase丧失了水解DNA的能力,同时与DNA结合。运用多维核磁共振方法归属了[E43S]SNase自由状态以及与DNA结合状态主链和侧链的共振峰,解析了DNA存在下[E43S]SNase的初步溶液结构,比较了E43S突变体自由态和结合态的主链动力学性质,结果表明:(1)参与蛋白-DNA界面的残基主要分布于第一个β-转角区、β3和Ω-loop之间的区域、Ω-loop区、p-loop区、β5的起始端以及第2个α-螺旋和第3个α-螺旋之间的loop上;(2)根据核磁共振滴定实验判断[E43S]SNase与单链DNA的结合力较强,根据滴定过程中谱峰的变化情况发现界面残基自由态和复合态之间化学交换的时间尺度很不一致,表明多位点参与了结合,并且各位点的结合力不同,它们共同贡献了蛋白对DNA较强的亲和力;(3)自由和复合态蛋白的主链S2与二级结构表现了一定程度的相关性;(4)8bp ssDNA结合引起涉及几乎整个蛋白区域的主链S2增加,使ps-ns时间尺度的运动性受到一定程度的限制,从而引起构象熵减小,构象自由能变大,不利于DNA结合。伴随着普遍性的ps-ns时间尺度内运动受限,DNA结合还引起活性位点及其临近残基经历了显著的构象交换运动,有效补偿了S2增加造成的熵损失,表现一个自身熵补偿机制,核酸酶与单链DNA结合可能是焓和熵共同驱动的;(5)建议了一个核酸酶水解单链DNA的模型。
2.金黄色葡萄球菌核酸酶1-110片段的折叠稳定性和协同性。
运用远紫外及近紫外圆二色谱、内源荧光光谱和核磁共振光谱等方法分析了G88W110、V66W110和2.0 M TMAO存在下SNase110的去折叠自由能、折叠构象和内运动特性。研究结果表明G88W、V66W单点突变以及小分子TMAO均可以使SNase110折叠成类天然构象。三个片段的结构表现了不同程度的折叠稳定性和三级堆积的紧凑性。三个片段的溶液三维结构显示它们都形成了稳定的β桶结构,α螺旋也初步形成,但都存在无序的结构。G88W110的结构最紧凑,而V66W110和2.0 M TMAO中的SNase110的结构比较松散。突变和渗透质对蛋白稳定性和运动性的影响不同,主链动态特性和脲变性曲线都表明三个片段处于不同的折叠状态。片段的结构和稳定性与β桶结构中β链的堆积程度紧密相关,β桶和整体结构的形成是相互关联的。在核酸酶片段的折叠过程中,β-桶很可能是折叠过程中结构调整的一个非局域成核位点。G20I/G29I突变引起三个片段的构象发生了显著变化,Ile18-Asp21和Tyr27-Gln30可能会形成局部成核位点并启动G88W110、V66W110和2.0M TMAO稳定的SNase110的折叠。核酸酶110片段的折叠在β-转角Ile18-Asp21和Tyr27-Gln30处启动,通过在β-桶区域形成非局域成核位点得以发展,两个α-螺旋开始折叠。当类天然长程相互作用以及其他作用力稳定了β-转角和β-桶区域时,整个折叠过程即协同进行。