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本实验以青春期昆明雄鼠为研究对象,通过较低浓度的氯化三丁基锡(Tributyltin chloride,TBTC1)(0.5,5,and 50μg/kg)灌胃实验,染毒45 d后,观察TBT对生殖系统的毒性效应,探讨其对精子发生及精子成熟损伤的机理和途径。有关精子发生方面的检测指标包括睾丸的组织形态学,睾丸成熟情况、血清促性腺激素和睾丸性激素水平、睾丸细胞凋亡和细胞增殖情况,血清甲状腺激素(T3、T4)水平和睾丸甲状腺激素受体(TRs)表达量(mRNA水平);有关精子成熟方面的检测指标包括附睾组织形态,精液质量参数、附睾功能标志物活性(中性α-葡萄糖苷酶和附睾酸性磷酸酶)、精子功能指标以及附睾内特异性表达基因(MMP7和TD02)的表达量(mRNA水平)。1 TBT对睾丸精子发生的影响。TBT处理后雄性小鼠性体比指数没有显著变化,但睾丸组织结构发生明显改变,而且损伤程度随TBT剂量增加而加重,在50μg/kg剂量组,生精细胞排列杂乱、无序,各级生精细胞间出现大量的间隙,大量生精细胞异常脱落进入生精小管管腔。和对照组比较,处理组睾丸睾酮水平呈现出TBT剂量依赖性显著升高,雌激素水平呈现剂量依赖性下降趋势,而血清黄体生成素水平以及卵泡刺激素水平较对照组有所下降。运用免疫组织化学和western-blotting的方法对睾丸内增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平进行研究,发现随着TBT浓度的增加,睾丸内PCNA表达量有下降趋势,但与对照组相比较,没有显著性变化。运用TUNEL技术检测TBT染毒45 d对小鼠睾丸生殖细胞凋亡的影响,发现各处理组凋亡阳性细胞数与对照组相比有所升高,但差异不显著。TBT处理后小鼠血清三碘甲腺原氨酸(T3)水平以及三碘甲腺原氨酸(T3)与甲状腺素(T4)比率呈现剂量依赖性显著下降,睾丸TRαmRNA表达量下调。2 TBT对附睾功能以及精子成熟的影响。TBT处理组小鼠精子密度、存活率和畸形率呈现剂量依赖性显著下降。组织形态学观察显示附睾头部未见明显变化,而体部和尾部可见不同程度的损伤,附睾损伤程度随着处理剂量的增加而逐渐加剧,呈现剂量依赖效应:体部附睾管上皮细胞逐渐稀少,排列疏松,管间间隙变大,腔内精子减少,中浓度组和高浓度组附睾管腔内可见大量精子凝聚;附睾尾部上皮细胞排列疏松,管间间隙逐渐变大,管腔内精子减少,管间结缔组织逐渐减少。TBT处理使附睾上皮特异性分泌物中性α-葡萄糖苷酶(NAG)活性有所下降,但与对照组相比,差异不显著:附睾酸性磷酸酶(ACP)活性随处理剂量的升高呈下降趋势,但与对照组相比无统计学差异。处理组精子顶体酶活性呈现剂量依赖性显著下降;精子乳酸脱氢酶同工酶-X活性在高浓度组受到显著抑制。与对照组相比较,5和50μg/kg TBT浓度组MMP7 mRNA表达量显著下降,TD02表达量呈现剂量依赖性显著下降。综上所述,本实验结果表明TBT能干扰青春期小鼠精子发生。组织学观察以及睾丸成熟度检查结果表明TBT能破坏睾丸组织的正常结构,抑制睾丸发育。TBT处理能够显著诱导睾丸睾酮水平上升,17-β雌二醇水平下降,血清LH和FSH水平有所下降,造成生殖内分泌系统紊乱,进而干扰睾丸精子发生。TBT处理显著降低血清T3含量,T3/T4比率显著下降,TRα表达水平下调,说明TBT能干扰甲状腺正常生理机能,进而诱发睾丸生精机能障碍。另外,处理组凋亡细胞数目的增加以及PCNA蛋白表达量的降低,提示TBT可在一定程度诱导睾丸生精细胞凋亡,抑制其增殖,这可能是TBT抑制精子发生的潜在机制之一。TBT干扰精子发生应该是多条途径共同作用的结果。本实验结果还显示TBT能干扰青春期小鼠精子成熟。组织形态学观察结果表明TBT对附睾组织结构造成损伤。精液常规检测结果显示处理组附睾精子密度下降,畸形率上升,同时精子存活率下降,提示TBT可影响哺乳动物精子质量。附睾酸性磷酸酶活性下降很可能与精子畸形率上升有一定关系。精子顶体酶以及乳酸脱氢酶同工酶-X活性的显著降低,提示精子成熟受到影响,这些精子质量功能指标的变化情况与精液常规检测结果一致,进一步证实TBT具有精子毒性。MMP7和TD02 mRNA表达量的显著下降,提示TBT可影响附睾内一些基因的表达,而这些基因很可能与附睾的功能或精子成熟有关。以上结果说明TBT具有附睾毒性以及精子毒性。TBT引起的精子数量和质量下降能影响动物的生殖。