【摘 要】
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家蚕（Bombyx mori）是鳞翅目昆虫的代表,也是重要的经济昆虫。家蚕核型多角体病毒（B.mori nuclear polyhedrosis virus,Bm NPV）属于杆状病毒科的嗜碱性粒细胞病毒属,是一种重要的家蚕病原,可以引起家蚕的血液型脓病,Bm NPV每年造成的经济损失约占所有蚕病引起损失的70%。目前,Bm NPV侵染家蚕细胞的分子机制还知之甚少,也尚无好的办法预防和防治Bm N
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家蚕（Bombyx mori）是鳞翅目昆虫的代表,也是重要的经济昆虫。家蚕核型多角体病毒（B.mori nuclear polyhedrosis virus,Bm NPV）属于杆状病毒科的嗜碱性粒细胞病毒属,是一种重要的家蚕病原,可以引起家蚕的血液型脓病,Bm NPV每年造成的经济损失约占所有蚕病引起损失的70%。目前,Bm NPV侵染家蚕细胞的分子机制还知之甚少,也尚无好的办法预防和防治Bm NPV引起的蚕病发生。家蚕在长期进化的过程中,使得自身具备了较为完善的先天免疫系统,通过解析家蚕免疫系统抵抗Bm NPV入侵的分子机制,可以为今后预防Bm NPV引起的蚕病奠定基础。细胞自噬是细胞自我吞噬的一种生理现象,可以降解细胞中糖类、蛋白质和脂类等物质维持细胞正常生长发育或是度过不良环境,同时细胞自噬也被认为是生物体抵抗病原入侵的免疫响应。本论文主要通过家蚕ATG8抗体的免疫荧光染色、构建带有不同标签蛋白的Bm NPV重组病毒来探究Bm NPV在侵染家蚕活体或Bm N细胞时对宿主体转录,尤其是细胞自噬的影响;检测不同内吞抑制剂对病毒侵染的作用为深入解析Bm NPV侵染宿主的分子机制奠定基础。本论文研究的主要结果如下:1.家蚕幼虫脂肪体中Bm ATG8蛋白荧光成点化的与蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）诱导的自噬一致家蚕幼虫4龄第2天至预蛹第2天的脂肪体细胞免疫荧光染色观察发现,在家蚕4龄眠和预蛹时期,脂肪体细胞内Bm ATG8蛋白的成点化较强与同期的细胞自噬吻合,并受到蜕皮激素信号的诱导。2.通过Bac-to-Bac杆状病毒构建系统成功构建Bm NPV重组病毒成功构建了2种重组载体:p Fast BacTMDual-egfp和p Fast BacTMDual-（egfp）（V5-Bm Atg8）,将重组载体上的目的基因转座至含有的Bm NPV病毒基因组的DH10菌株中Tn7转座位点上,成功构建了含有不同基因的Bm NPV重组病毒:Bm NPV-egfp和Bm NPV-（egfp）（V5-Bm Atg8）。3.转录组筛选Bm NPV侵染家蚕脂肪体组织后的表达量差异基因转录组分析发现:与对照组相比,Bm NPV-egfp侵染24 h后家蚕脂肪体中有104个基因表达出现显著性差异,其中上调基因有36个,下调基因有68个;而在Bm NPV-egfp侵染72 h后,有4384个基因表达出了显著性差异,其中有4132个基因上调,252个基因下调。上述结果说明:在侵染24 h后Bm NPV-egfp对宿主转录水平影响较小,而在72 h后影响严重。对Bm NPV-egfp侵染与对照组相比获得的表达量差异的功能基因进行GO分析发现:在Bm NPV-egfp侵染后,家蚕体内代谢过程、催化活性以及离子结合等生物学过程都有显著变化;通过KEGG分析发现,在Bm NPV-egfp侵染后家蚕脂肪体自噬、凋亡、PI3K-Akt、FOXO、m TOR以及TNF等信号通路均有显著性变化。通过对24、72h所有差异基因进行筛选后,共筛选出了154个与自噬响应、免疫反应、凋亡作用以及内吞相关的差异基因。4.细胞松弛素D抑制Bm NPV在Bm N细胞中的侵染与对照组相比,加入细胞松弛素D预处理30 min的Bm N细胞在病毒侵染48 h时后,以EGFP蛋白指示的Bm NPV亮度明显低于对照组;并且收取病毒液通过滴度检测发现产生的Bm NPV病毒滴度显著低于对照组;最后进行实时荧光定量PCR检测发现,细胞松弛素D处理的细胞中病毒前期表达基因ie-1明显低于对照组,说明细胞松弛素D影响的内吞形式也参与Bm NPV侵染Bm N细胞的过程。上述结果表明,在家蚕幼虫5龄时期,脂肪体细胞的自噬水平较低,而Bm NPV在侵染家蚕脂肪体后能够引起包括自噬以及凋亡、PI3K-Akt、FOXO、m TOR、TNF等信号通路的显著变化。最后本论文验证了细胞松弛素D影响的内吞作用参与Bm NPV对Bm N细胞的侵染过程。
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