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神经肽LFRFamide和GnRH是2种由神经内分泌细胞产生,可能具有生殖调控等多种功能的小分子多肽。曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)是我国东海区重要的经济头足类,人工养殖已初具规模但存在种质退化、性早熟等问题,严重制约产业价值的提升。鉴于LFRFamide和GnRH可能参与乌贼的生殖等多种调控,本文对曼氏无针乌贼这2种神经肽基因进行克隆、表达组织特异性分析和不同脑组织功能区mRNA特异表达位点展开研究,初步推测了LFRFamide和GnRH在乌贼生殖中的调控作用。研究结果如下:1.曼氏无针乌贼神经肽LFRFamide基因cDNA全长841bp,包含一段长567bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),5’非编码序列91bp,3’非编码序列183bp。188个氨基酸的前体蛋白中,包含一段长22个氨基酸的信号肽和4种不同拷贝数的成熟多肽产物:1拷贝的六肽NSLFRFa、3拷贝的六肽GNLFRFa、1拷贝的五肽TIFRFa、1拷贝的七肽PHTPFRFa。前体蛋白相对分子质量(MW)为21.5kDa,等电点(pI)为9.40。氨基酸序列中成熟多肽C-端Phe-Arg-Phe(FRF)残基较为保守,进化树构建分析后将其归属到LFRFamide亚族。通过荧光定量PCR方法检测出LFRFamide基因在雌乌贼的脑组织中有显著表达,缠卵腺和副缠卵腺中有微量表达;在雄性乌贼中,仅脑组织有显著性表达。通过原位杂交方法检测出LFRFamide基因在乌贼脑的食道上神经团中的脑亚脚叶(subpeduncle lobe,SPL)、亚垂直叶(subvertical lobe,SVL)、前基叶(anterior basal lobe,ABL)、后基叶(posterior basal lobe,PBL)和上额叶(superior frontal lobe,SFL),食道下神经团的(subraoesophageal mass,SEM)巨细胞叶(magnocellular lobe,MAG)、外套内脏叶(palliorisceral lobe,PVL)、前色素细胞叶(anterior chromatophore lobe,ACL)、前足叶(anterior pedal lobe,APL)和腕神经叶(brachial lobe,BL),以及视叶中有表达。初步推测LFRFamide可能参与调控色素囊变化、取食和生殖活动。2.曼氏无针乌贼神经肽GnRH基因cDNA全长710bp,包含一段长273bp的ORF,5’非编码序列85bp,3’非编码序列352bp。前体蛋白由90个氨基酸组成,包含一段长31个氨基酸的信号肽,12个氨基酸的成熟多肽:pQNYHFSNGWHPG和44个氨基酸的辅助序列。前体蛋白预测相对分子质量10.1 kDa,pI为7.71。氨基酸序列仅成熟多肽部分保守,进化树中与无脊椎动物GnRH聚类为一支。通过荧光定量PCR方法检测出神经肽GnRH基因在雌乌贼的脑组织中有显著表达,卵巢中有微量表达;在雄性乌贼中,仅脑组织有显著性表达。通过原位杂交方法检测出GnRH基因在乌贼脑的食道上神经团中的脑亚脚叶、亚垂直叶、前基叶、后基叶和下额叶(inferior frontal lobe,IFL),食道下神经团的巨细胞叶、外套内脏叶、前色素细胞、足叶(pedal lobe,PL)和腕神经叶,以及视叶中有表达。推测GnRH可能参与调控曼氏无针乌贼生殖活动。本研究首次克隆了曼氏无针乌贼神经肽LFRFamide和GnRH基因的cDNA全长序列,分别对雌性和雄性乌贼展开了2种神经肽基因的组织表达特异性分析,并对其mRNA在乌贼脑组织中的特异表达位点进行了细胞定位。初步研究了这2种神经肽对曼氏无针乌贼的生殖调控作用,研究结果为曼氏无针乌贼的种质资源保护和人工繁育提供一定的理论基础。