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猪病毒性传染病危害巨大,其传播速度快、流行广,多呈混合感染,可引起免疫抑制、繁殖障碍、呼吸困难、消化功能紊乱等临床症状,给养猪业带来严重的经济损失。猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)主要引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状。猪流感病毒(Swine Influenza virus,SIV)可引起猪群急性、热性呼吸道疾病,尽管死亡率低,但猪群是人、禽流感病毒基因重组的“混合器”,可引发流感的大爆发。戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起机体以黄疸为主要临床症状的急性病毒性肝炎,呈现全球性流行,对孕妇的致死率为30%,HEV阳性抗体在猪群内检出率很高。因此,建立一个准确、快速的病毒性传染病诊断体系,对猪病临床诊断以及与养猪业相关的公共卫生有着极其重要的作用。液相蛋白芯片检测技术(Multiplex Fluorescent Microsphere Immunoassay,MFIA)具有快速、重复性好、特异性高、准确度高的特点,更重要的是可进行高效的多重检测。本研究旨在以猪重大疫病PRRSV、重要猪源人兽共患病SIV和HEV为代表,分别建立三种病毒病抗体单一液相蛋白检测技术,并在此基础上进行科学整合,建立可以同时检测三种疾病抗体的多重液相蛋白芯片检测方法。本研究首先构建了PRRSV Nsp7、SIV HA、HEV ORF2蛋白原核表达体系,对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot验证,采用镍柱亲和层析法进行纯化,获得的Nsp7、HA、ORF2重组蛋白具有良好的抗原性,为后期液相蛋白芯片检测方法的建立提供了前提。Nsp7、HA、ORF2蛋白作为抗原分别与61、46、12号微球偶联获得Nsp7-61号、HA-46号、ORF2-12号偶联复合体,以其为捕获载体建立液相蛋白检测方法。结果显示:应用单一方法进行检测时,对单克隆抗体的最低检测浓度为1ng/mL,当猪阳性血清稀释至1:800时仍可检测为阳性;与猪常见的其他疾病阳性血清无交叉反应;PR RSV、SIV、HEV单一液相芯片检测方法的平均批内变异系数分别为3.2%、6.2%、5.8%,平均批间变异系数分别为4.2%、6.5%、6.6%。采用FMIA和ELISA对临床血清样本PRRSV 115份、SIV 110份、HIV 102份检测结果显示:PRRSV、SIV、HEV单一液相芯片检测方法的灵敏度分别为94.9%、96.6%、90.5%,特异性分别为91.1%、93.8%、95.0%,两者的符合率分别为93.0%、90%、93.1%。同时关联性检验结果(p<0.01)表明,MFIA和ELISA关联性显著;优势卡方检验结果(p>0.05)表明,MFIA有一定的优势,但是差异不显著。PRRSV单一液相芯片检测方法对PRRSV疫苗免疫猪血清检测结果显示:Nsp7蛋白抗体水平在21dpi(days post immunization,dpi)时开始转阳,比N蛋白抗体水平转阳(14dpi)晚,比GP5蛋白抗体水平转阳(28dpi)早,Nsp7蛋白抗体水平转阳之后并持续上升,在42dpi时抗体水平最高。对三个单一液相蛋白芯片检测方法进行整合,建立了用于检测PRRSV Nsp7抗体、SIV HA抗体、HEV ORF2抗体的三重液相蛋白芯片检测方法。结果表明,PRRSV、SIV、HEV多重检测特异性强,无交叉反应,与单一检测时MFI值的相关系数(R2)分别为0.9901、0.9955、0.9907。综上所述,本研究建立了用于检测PRRSV Nsp7抗体、SIV HA抗体、HEV ORF2抗体3个液相蛋白芯片单一检测方法,同时建立了检测HEV、PRRSV、SIV抗体的多液相蛋多重白检测方法,为HEV、PRRSV、SIV抗体监测提供一种高通量、重复性好、特异性高的抗体检测体系。