论文部分内容阅读
背景:心肌肥厚是一种代偿机制,主要发生于长期压力负荷过重的情况下,其过程受到多种基因的调节。细胞型Fas相关死亡区域蛋白样β白介素-1转换酶抑制蛋白(cellular Fas-associated death domain-like interleukin-1β-converting enzyme (FLICE)-like inhibitory protein, cFLIP)是肿瘤坏死因子相关信号传导通路成员之一,在细胞凋亡过程中起调节作用。目前在人体内已发现的cFLIP分两种:长链FLIP (FLIPL,55-60kDa)和短链FLIP (FLIPS,26kDa). cFLIPsN-端只有2个串联的死亡效应域(DED),而cFLIPL除2个DED外还含有1个caspase同源结构域,即caspase蛋白水解酶区域,因起催化活性的半胱氨酸、组氨酸分别被酪氨酸、精氨酸取代,故不具备酶的活性。cFLIPL与cFLIPs都可被接头分子FADD招募至死亡诱导信号传导复合体(DISC)上,从而caspase-8与DISC的结合反应使caspase-8无法激活,caspase级联反应不能触发,从而强效抑制Fas、TRAIL、TNF-α等多种死亡受体诱导的细胞凋亡。已有文献表明,cFLIP在晚期心衰病人心室肌中表达水平显著下降。而cFLIP在心肌肥厚及心肌纤维化中的作用尚不明确。我们检测扩张型心肌病心衰患者心脏组织中cFLIP的表达情况,并运用cFLIP基因敲除及转基因小鼠研究cFLIP在缩窄胸主动脉增加心脏后负荷建立小鼠心肌肥厚模型中的作用,并进一步研究其相关的机制。方法:实验一:使用人体心脏左心室组织样本,取自正常心脏捐献者(配型失败),以及扩张型心肌病发展至心衰阶段,且需要进行心脏移植的患者。采用蛋白质印迹法(Western Blot)在蛋白水平检测cFLIP的表达情况。实验二:选取体重在25-26g,8周龄的雄性CD1品系野生型小鼠和CD1小鼠背景的cFLIP基因敲除(cFLIP+/-)小鼠为实验对象,使用主动脉缩窄术(aortic binding, AB)建立小鼠心肌肥厚模型,术后4周利用超声检测评价小鼠心功能相关指标,采用组织病理学方法评价心肌肥厚及纤维化程度,实时定量聚合酶链式反应在mRNA水平检测心肌肥厚标志物ANP, BNP, p-MHC,以及心肌纤维化标志物结缔组织生长因子(CTGF),Ⅰ、Ⅳ型胶原(collagen Ⅰ, Ⅳ), TGF-β1等分子生物学指标。实验三:选取体重在25-26g,8周龄的雄性CD1品系野生型小鼠(NTG)和CD1小鼠背景的cFLIP心脏特异性转基因小鼠(TG)为实验对象,使用主动脉缩窄术(aortic binding, AB)建立小鼠心肌肥厚模型,主要检测指标同实验二结果:实验一:Western Blot结果显示正常心脏中cFLIP的表达水平明显高于扩张型心肌病患者心脏cFLIP表达水平。实验二:超声检测显示,在主动脉缩窄术诱导的心肌肥厚模型中,cFLIP基因敲除小鼠短轴缩短率(Fractional shortening, FS)较野生型小鼠降低;左室舒张末期内径(Left ventricular end-diastolic dimension, LVEDD)及左室收缩末期内径(left ventricular end systolic dimension, LVESD)较野生型小鼠升高;取材结果显示主动脉缩窄术诱导的心肌肥厚模型中,cFLIP基因敲除小鼠大体心脏较野生型小鼠的大体心脏明显增大,且心重体重比值(Heart weight/body weight, HW/BW)和肺重体重比值(Lung weight/body weight, LW/BW)均高于野生型小鼠;HE、WGA和PSR染色显示cFLIP基因敲除小鼠心肌细胞面积及纤维化面积较野生型小鼠增加;且RT-PCR结果显示cFLIP基因敲除小鼠小鼠心肌组织中的ANP, BNP,β-MHC, CTGF, collagens I, collagens IV和TGFβ1的mRNA表达水平较野生型小鼠升高。实验三:超声结果显示,在主动脉缩窄术诱导的心肌肥厚模型中,cFLIP转基因小鼠短轴缩短率(Fractional shortening, FS)较野生型小鼠升高;左室舒张末期内径(Left ventricular end-diastolic dimension. LVEDD)及左室收缩末期内径(left ventricular end systolic dimension, LVESD)较野生型小鼠降低;取材结果显示在主动脉缩窄术诱导的心肌肥厚模型中,cFLIP转基因小鼠的心重体重比值(Heart weight/body weight, HW/BW)和肺重体重比值(Lung weight/body weight, LW/BW)均低于野生型小鼠;HE、WGA和PSR染色显示cFLIP转基因小鼠心肌细胞面积及纤维化面积较野生型小鼠减小;且RT-PCR结果显示转基因小鼠心肌组织中的ANP, BNP, β-MHC,CTGF, collagens Ⅰ, collagens Ⅳ和TGFβ1的mRNA表达水平较野生型小鼠降低。结论:cFLIP可抑制心肌肥厚及纤维化,对心功能起保护作用。