目的：1.阐述中西医对白癜风的认识及导师杨柳教授关于白癜风的学术思想。2.初步考察复色2号方对黑素代谢的影响。3.复色2号方酊剂和凝胶剂的制备及其安全性考察。4.初步观察复色2号酊剂及凝胶的临床疗效。5.进行白癜风中医临床流行病学调查。方法：1.白癜风是一种皮肤色素脱失性疾病,表现为皮肤局限性或泛发性色素脱失斑,发生于面部者将直接影响其容貌,给患者生活、学习、工作、交际等带来负面影响,重者给患者带来较重的心理压力。但因其病因不明、少症难辨,历来就是医学界的难题。本文简要阐述中西医对白癜风的认识,重点阐述导师杨柳教授关于白癜风的学术思想。杨柳教授从医30余载,从事白癜风的研究与治疗20余载。不仅学古通今、博采众长,而且临床经验丰富。针对少症难辨的现象,老师提出应根据白斑的发展与否、发展快慢,将白癜风分为进展期和稳定期进行辨证,这样有利于临床的辨证治疗。并根据自己多年经验总结了治疗白癜风的经验方,进展期的复色1号和稳定期的复色2号方。老师认为白癜风进展期主要表现特点与病机为“风”,治则方药要有“祛风”的思考,故复色1号方重在祛风活络,调和气血。稳定期白癜风,“久病多虚、多瘀”,主要表现为肝肾不足的“虚”与瘀阻脉络“瘀”,治疗当以补益肝肾与活血通络为主要治则,再辅以祛风和血,故复色2号方重在滋肾活血,调和气血。基于“中药色象理论”,指出白癜风临床用药在辨证论治的基础上可考虑优先选用深颜色的药物。复色1号方的实验及临床研究已被导师带领的科研团队重点阐述。本次课题研究重在初步探讨研究复色2号方对黑素代谢的影响,及其酊剂和凝胶剂的制备及安全性,并对其临床应用进行观察与评价。此外,本课题还通过对门诊80例病人进行流行病学调查,目的是了解病人患病的主要诱因,以进一步指导分期论治中的辨证分型,证明分期论治的必要性。2.细胞实验：采用MTT法测定复色2号方水提取物(浓度分别为lg/L、10g/L、50g/L、100g/L、1000g/L)培养的鼠B16黑素瘤细胞吸光度值(A值),以了解其对鼠B16黑素瘤细胞增殖的影响；根据MTT实验结果,选取药物浓度,采用多巴速率氧化法测定复色2号方水提取物(浓度分别为lg/L、10g/L、50g/L、100g/L、1000g/L)对细胞内酪氨酸酶活性的影响；采用NaOH裂解法测定鼠B16黑素瘤细胞黑素含量。3.酊剂及凝胶剂的稳定性实验：称取复色2号方浸泡于75%的酒精,制成酊剂；瓦罐熬制复色2号方并浓缩,制成复色2号方的水提取物,并添加基质——卡波姆940、吸湿剂及增稠剂——PEG-4000和甘油,中和剂——三乙醇胺,透皮剂——月桂氮卓酮,防腐剂——凯松,按照凝胶剂的制备方法制成凝胶剂。通过不同时间段观察酊剂的气味、外观、澄清度评价复色2号方酊剂的稳定性；通过自身涂布的方法考察不同时间段复色2号方凝胶剂的细腻度,并考察不同时间段凝胶剂的外观及气味有无改变,结合恒温培养箱、冰箱、离心及室温贮存的方法考察凝胶剂的稳定性。4.动物实验。①皮肤刺激试验：取300-400g豚鼠4只,背部剃毛,并将其背部皮肤分为四个区域,每个区域面积约2.0×2.0cm2,将酊剂组、凝胶组、酊剂对照组(75%乙醇)和凝胶对照组(0.16%月桂氮卓酮)按拉丁方设计方法均匀涂在相应的区域,不得使药物流失。用保鲜膜、纱布、绷带覆盖封包,并防止敷料脱落。每天将酊剂组、凝胶组、酊剂对照组(75%乙醇)和凝胶对照组(0.16%月桂氮卓酮)同时涂布1次,6小时后,用温水洗去残留的药物,连续14天。每次洗去药物后1小时观察并记录各个区域涂药后的红斑、水肿情况,是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤变薄等情况,并对红斑水肿进行评分。第14天涂药后,需观察去除药物后1小时、24小时、48小时及72小时涂抹部位的红斑、水肿情况,是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤变薄等情况,并对红斑水肿进行评分。②皮肤变态反应试验：取大鼠50只,按随机数表法分为5组,每组10只,即复色酊剂组、复色凝胶组、阳性对照组(2,4一二硝基氯代苯)、酊剂空白对照组(75%乙醇)、凝胶剂空白对照组(0.16%月桂氮卓酮)。大鼠背部剃毛,分为左右2个区域,每个区域面积约3.0×3.Ocm2。在大鼠的左侧皮肤进行致敏给药实验,在大鼠的右侧皮肤进行激发给药实验。第一,致敏给药：第一天将5种受试物分别涂在5组大鼠左侧皮肤,6小时后用温水洗去残留受试物,第7天和第14天以同样方法重复一次。第二,激发给药：于末次给受试物致敏后即第14天给药后,将5组药物分别对应涂布于大鼠背部右侧皮肤。6小时后,温水洗去受试物,立即观察涂抹部位有无红斑、水肿情况,是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤变薄等情况,并对红斑水肿进行评分。并于24小时、48小时和72小时重复观察并评分。5.临床观察：统计并观察50例稳定期白癜风患者使用复色2号酊剂和凝胶剂进行治疗后的皮损情况,以此评价复色2号方制备的酊剂和凝胶剂经皮肤用药的安全性及疗效,并选取4例典型病例进行案例分析。6.统计方法：以SPSS13.0统计软件对实验数据进行统计分析,计量资料以x±S表示,两组组间显著性检验用独立样本T检验：多组组间显著性检验用one-way Annova分析或协方差分析,多因素多水平显著性检验用析因分析资料的方差分析,组间多重比较采用bonferroni检验分析。当P<0.05时,差异有统计学意义。结果：1.浓度为lg/L、10g/L、50g/L、100g/L、1000g/L的复色2号方水提取物对小鼠B16黑素瘤细胞的增殖无统计学意义(P>0.05)；与对照组相比,浓度为lg/L、10g/L、50g/L、100g/L、1000g/L的复色2号方对酪氨酸酶活性有显著促进作用(F=2011.88,P<0.001),呈浓度依赖性；与对照组相比,浓度为1g/L、10g/L、50g/L、100g/L、1000g/L的复色2号方对黑素含量有显著促进作用(F=387.98,P<0.001),呈浓度依赖性。2.复色2号酊剂澄清,呈紫褐色,味辛,浓度为相当于原生药的22%,相对密度和乙醇含量均符合《中国药典》酊剂项下的有关规定,pH计测得pH值为5.15±0.003。酊剂样品在室温下放置1个月和6个月后酊剂的包装无变化,外观颜色澄清度均无明显变化。1个月后测得pH值为5.14±0.008,6个月后测得pH为5.12±0.012。复色2号凝胶剂为棕色,半透明,色泽均匀,质地细腻,稠度适中。常温贮存24小时、1个月、2个月、3个月及6个月后凝胶的外观、色泽及稠度无明显变化、无分层和变色现象,耐寒耐热实验及离心实验凝胶无变粗、分层、变色和沉淀现象。pH计测得的平均值为7.36±0.012。室温3个月后再次检测pH值的平均值分别为7.34±0.011,故随时间变化,凝胶剂pH值变化不明显。3.根据皮肤刺激反应评分标准进行判断可知,复色2号方酊剂及凝胶剂对豚鼠皮肤无红斑、水肿和脱屑等刺激反应；根据皮肤变态反应评分标准和致敏率分类进行判断可知,复色2号方酊剂及凝胶剂对大鼠皮肤无红斑、水肿等过敏反应,也未见哮喘、休克等全身过敏反应。阳性对照组致敏实验和激发实验示所有大鼠均出现红斑和水肿,大鼠皮肤变态反应积分均>1,致敏率100%。4.临床观察发现,采用复色2号酊剂及凝胶剂治疗的50例白癜风患者均未出现皮肤刺激及过敏反应。列举的3例白癜风患者,经过内服与外涂药配合治疗后,疗效明显,且皮损未出现瘙痒、红斑、丘疹、水肿、水疱、苔藓样变等不良反应。5.经过分析比对《白癜风中医临床流行病学调查表》可知,白癜风疾病的发生与加重无明显诱因,但与遗传、情绪、环境污染可能有一定相关性,因为有些病人的发病与加重确实有家族史或是在患者遭遇巨大变故之后或周边环境污染严重之后出现,但有些患者发病与加重则无明显诱因,故白癜风的诱因尚不明确,只能说其与哪些因素相关性明显。中医对白癜风的辨证情况也是众多纷纭,通过调查表分析可知,白癜风患者中肝郁患者居多,可能因为白癜风本身是损容性疾病,患者承受着较大心里压力有关,或多或少会有些心情压抑。脾虚、肾虚、湿停也可在不同的白癜风患者身上出现。结论：1.复色2号方对酪氨酸酶和黑素合成均具有促进作用,且呈浓度依赖性,一定程度上为阐释复色2号方治疗白癜风的作用机制提供了实验依据。2.皮肤刺激试验及皮肤变态反应试验显示复色2号酊剂及凝胶剂对豚鼠皮肤无刺激性,对大鼠皮肤无致敏性。复色2号酊剂及凝胶剂经皮肤用药安全。3.临床上复色2号酊剂及凝胶剂安全性好,患者未出现明显皮肤过敏等不良反应。4.通过《白癜风中医临床流行病学调查表》的结果分析表明,情绪因素对白癜风有较大的影响,会加重患者的压抑心理,故医生在用药物治疗的同时,应对患者进行适当的心理疏导；同时,调查表可以指导我们对该病的辨证分型和对症治疗。