传染性造血器官坏死病病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV）是一种高致病性的冷水鱼病毒,是影响世界水产养殖经济的重要病原体,导致各种鲑鱼物种的临床疾病和死亡,其暴发可能导致鲑鱼饲养场出现80-100%损失。IHNV目前有五种基因型,流行区域不同,我国主要流行JRT型。目前大量研究投入到IHNV感染预防和治疗方面,尤其是针对不同基因型。本实验室于2016年接收到来自四川省成都地区的五份虹鳟感染病料,并分离得一株JRT型IHNV,命名为DY2016。通过研究IHNV DY2016感染虹鳟的变化规律,以及在转录组学的基础上获得的大量病毒和宿主相互作用的信息,将有助于了解JRT型IHNV的复制和致病机制,进而为JRT型IHNV的综合防控提供新的策略。干扰素（interferon,IFN）是先天免疫系统抵抗病毒入侵的重要防线,在脊椎动物的进化中十分保守。虽然对人、小鼠等哺乳动物的IFN进行了较为深入的研究,但目前对虹鳟IFN的功能及其应用知之甚少。研究虹鳟IFNa在抵御JRT型IHNV的感染上能够发挥多大作用,将有助于研制出安全、高效、新型的抗病毒制剂和免疫增强剂用于增强虹鳟对JRT型IHNV的抵抗力。本研究通过人工感染虹鳟幼鱼,了解IHNV DY2016的发病规律和临床症状特征,然后利用RNA-Seq技术（Illumina）测定了IHNV DY2016感染后虹鳟肾脏组织中m RNA的表达谱,对JRT型IHNV的致病机制进行了一个初步探究。随后对虹鳟IFNa进行克隆和分子结构分析,通过大肠杆菌原核表达技术获得虹鳟重组IFNa（rainbow trout recombinant IFNa,rtrIFNa）,并在体内外分析了rtrIFNa抵抗IHNV DY2016的免疫效益。研究结果如下:1.IHNV DY2016的分离鉴定和进化分析分析了2016年四川大邑地区养殖场虹鳟的发病原因,通过临床症状观察,组织病理学分析,细胞分离和套氏RT-PCR鉴定,得出导致本次虹鳟患病的病原为IHNV,并命名为DY2016。通过设计特异性引物扩增IHNV DY2016的糖蛋白（G）基因的全长核苷酸序列,TA克隆后进行测序分析,将获得的核苷酸序列上传至NCBI,获得基因登陆号MN475923。基于IHNV G基因核苷酸序列构建系统发育树,以评估DY2016与47株IHNV世界分离株的遗传相关性。由系统发育分析可知DY2016与亚洲IHNV分离株密切相关,DY2016与NCBI中公布的中国分离株的同源性为98.7%-99.3%,由此可知DY2016属于JRT基因型Nagano亚组中的单系。DY2016与韩国/日本JRt基因型IHNV分离株的最大核苷酸多样性分别为5.7%和4.7%,亚洲地区JRT基因型分离株的最大核苷酸多样性为6.3%,其多样性约是其他几个基因型的2-3倍,表明JRT基因型的IHNV具有相对较快的进化速度。2.IHNV DY2016的急性感染分析采用寇氏法（Karber method）,计算得IHNV DY2016的半数致死浓度(LC50)约为8.61×10~2TCID50/m L。使用剂量为6.84×10~3 TCID50的IHNV DY2016腹腔注射感染虹鳟幼鱼（15g±2）,16℃室温下观察。IHNV DY2016感染24h后虹鳟幼鱼陆续出现精神沉郁,体色发黑,腹部膨胀,眼球突出等临床症状。生存曲线显示,虹鳟在IHNV DY2016感染48h后开始出现死亡,一周以后累计死亡率达到100%。IHNV DY2016感染4d后,血液中红细胞和血红蛋白含量降低,血清中总蛋白、白蛋白和球蛋白的含量降低,肌酐、尿素、总胆汁酸、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶和葡萄糖的含量增加,血清钾增加,血清钠降低。采集感染后48h和96h虹鳟的主要实质器官,包括肝脏,脾脏,肾脏,头肾,心脏,脑,鳃和肠,进行苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色观察,发现IHNV DY2016对各组织器官造成的病理损伤程度不同,主要组织病理变化为细胞的坏死和严重的炎症反应。对感染的组织匀浆后再次接种细胞,成功分离到IHNV病毒,提示本次IHNV急性感染成功。3.IHNV DY2016感染虹鳟肾脏的转录组学研究通过Illumina HiSeq Xten高通量测序技术检测IHNV DY2016感染24h后的虹鳟肾脏组织m RNA的变化。结果显示,IHNV DY2016感染后,共获得差异基因2225个,其中显著上调的基因有1217个,显著下调的基因为1008个。对差异表达基因（Differentially expressed gene,DEG）进行GO富集分析,结果显示DEG主要参与信号传导、免疫反应、细胞代谢以及细胞粘附作用等,其中下调基因的GO-BP富集相关信号通路有免疫应答,中性粒细胞趋化性,白细胞的迁移等。KEGG信号通路富集分析显示,上调的DEG主要富集于蛋白酶体,坏死性凋亡,Toll样受体信号通路等,下调的DEG主要富集的通路有磷酸戊糖途径,细胞因子-细胞因子受体相互作用,细胞粘附分子等。众多差异基因中,与补体系统和适应性免疫系统相关的基因,以及血红蛋白亚基基因都受到不同程度的下调表达。与干扰素系统和凋亡系统相关的基因则受到上调表达,尤其是干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes,ISGs）。这些基因在病毒感染过程中的表达变化可能在抗病毒环节发挥着重要的作用,但其相关机制还需进一步研究。随机挑选6个DEGs进行q RT-PCR验证,结果与测序结果一致,证实转录组结果是可信的。4.虹鳟IFNa基因的克隆表达及其分子特征分析参考NCBI GenBank中已经公布的虹鳟I型干扰素IFNa（Gen Bank登录号:AM489418）,采用Signal P 4.1工具查找并去除信号肽序列,设计引物,用于虹鳟IFNa功能区的PCR扩增,然后将IFNa的PCR产物克隆至T载体并进行序列测定。结果显示:本次克隆的虹鳟IFNa功能区全长453bp,预测编码151个氨基酸,属于亲水性蛋白,理论等电点为9.12,具有2个潜在的糖基化位点和4个潜在的磷酸化位点。本次克隆所得IFNa基因氨基酸序列与NCBI中虹鳟IFNa1蛋白（登录号CAM28541.1）和IFNa3蛋白（登录号AAV39394.1）的氨基酸序列一致性分别为94.0%和98.0%。将测序结果上传至Gen Bank,获得基因登陆号为MK408448。将已克隆的IFNa连接到表达载体p ET32a（+）,构建p ET32a（+）-IFNa表达质粒,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,建立稳定的重组IFNa原核表达与蛋白纯化系统。经SDS-PAGE测定,rtrIFNa蛋白质相对分子质量约为35k Da,透析复性后的蛋白质浓度约为500μg/mL。5.rtrIFNa抗IHNV DY2016的活性分析将rtrIFNa体外作用于虹鳟性腺细胞系RTG-2,发现rtrIFNa具有很好的抗IHNV DY2016的生物活性,并存在一定的剂量依赖性,工作浓度在0.1μg/m L时就能保护半数细胞不受病毒影响,活性约为1×10~4U/mg。根据IHNV DY2016的核蛋白N基因,建立多重实时荧光定量PCR检测病毒的增殖情况,p MD19-N质粒模板在0.6×10~6～0.6×10~1copies/μL范围内与CT值之间呈现良好的线性关系,且最低检出量为6 copies/μL。结果显示,rtrIFNa作用后病毒N基因的拷贝受到强烈抑制。采用相对荧光定量技术分析了rtrIFNa对干扰素刺激基因的诱导表达效果,发现与对照组相比rtrIFNa可以显著性地提高ISGs的转录表达水平。说明rtrIFNa具有很好的内源IFNa的活性。以100μg/鱼的剂量经腹腔注射向虹鳟幼鱼接种rtrIFNa,免疫24h后,使用6.84×10~3 TCID50剂量的IHNV DY2016进行攻毒。结果显示,对照组幼鱼感染2d后开始死亡,而rtrIFNa处理组幼鱼在感染4d后才开始死亡,rtrIFNa在14天内的相对保护率达到45%。6.rtrIFNa体内抗IHNV DY2016免疫保护研究以100μg/鱼剂量的rtrIFNa免疫虹鳟幼鱼24h后攻毒,采集感染3d后幼鱼的肝,脾,肾和头肾组织,通过制作HE切片分析组织的病理损伤情况。结果显示rtrIFNa的使用能有效改善IHNV DY2016感染所造成的组织损伤。此外,对以上组织中的SOD活力和MDA含量进行测定发现,rtrIFNa的使用能显著提高肝,脾,肾和头肾各组织中SOD的抗氧化能力,抑制MDA含量的增加,对组织细胞具有一定的保护及修复作用。对不同组织中IHNV DY2016的N基因的拷贝数进行定量发现,N基因在不同组织中的拷贝数存在差异,肾脏中的含量最高,其次是脾脏和头肾,最后是肝脏,说明IHNV DY2016具有较强的组织嗜性,这也符合IHNV DY2016感染会导致不同组织出现不同程度病理损伤这一现象。rtrIFNa作用后,显著降低了IHNV DY2016在各组织中的增殖速度。rtrIFNa的使用还能有效增加组织中IFNa、CD4、Ig M、MHCII、CD8、MHCI、IL2和TNFα免疫基因的表达量,增加了血清中抗IHNV抗体的浓度。