论文部分内容阅读
一、研究背景及目的在全球范围内,肝细胞癌(HCC)的发病率、死亡率居高不下,缺乏特异性肿瘤分子标记物及治疗靶点是重要原因之一。基于本课题组前期生物信息学分析筛选及文献研究,PRRC2C(proline rich coiled-coil2C)在HCC中与正常肝组织存在表达差异,目前尚未有在肝细胞癌中作用的报道,亦不了解其作用机制。本课题组提出PRRC2C是HCC的驱动基因并促进HCC细胞增殖及转移的假设。据此,我们设计了实验步骤,分别从细胞水平,动物模型上,人肝癌组织芯片三个层面研究PRRC2C对肝细胞癌生物学行为的影响、作用机制及临床意义,探讨其作为肿瘤分子标记物及治疗靶点的潜在价值。二、方法1.验证PRRC2C基因在4种人肝癌细胞系BEL-7402、BEL-7404、SMMC-7721、Hep G2细胞中表达丰度;2.利用慢病毒介导的RNAi技术,构建BEL-7404、SMMC-7721细胞的PRRC2C基因沉默细胞模型(实验组shPRRC2C,对照组shCtrl);3.利用Celigo细胞计数检测、Annexin V-APC单染法流式细胞仪检测、细胞克隆形成检测、MTT实验检测肝癌细胞体外增殖能力的变化;4.构建裸鼠体内荷瘤模型,观察体内成瘤情况变化;5.利用细胞划痕损伤愈合实验,Transwell小室迁移、侵袭实验,检测肝癌细胞迁移和侵袭能力的变化;6.通过检测EMT相关基因E-cadherin、N-cadherin、Twist1、Snail、Slug、Smad2/3/4表达,探讨PRRC2C在肝癌转移中机制;7.利用免疫组化法,检测PRRC2C在HCC临床标本中的表达,并分析与临床病理特征及生存的关系。三、结果1.qPCR检测PRRC2C基因在4种人肝癌细胞系中内源表达均为高;2.显微镜下观察慢病毒感染BEL-7404、SMMC-7721细胞效率达到80%以上;qPCR在mRNA水平检测PRRC2C基因敲减效率在2株细胞分别达到74.0%、64.6%;提示慢病毒介导的RNAi可以有效沉默PRRC2C基因;3.沉默PRRC2C基因后,相对于对照组,实验组细胞计数减少,凋亡数增多,细胞克隆数减少,有活力细胞数减少;4.裸鼠实验中,实验组区域内总荧光表达量、处死当日成瘤体积及重量均较对照组减少;5.实验组24小时划痕迁移率减少,迁移、侵袭细胞数较对照组减少;6.实验组N-cadherin、vimentin的表达较对照组明显下降;7.PRRC2C的表达与HCC的T分期、TNM分期、P53蛋白表达相关,与Ki67密切相关;生存分析显示PRRC2C表达与生存率负相关,多因素分析显示PRRC2C表达和M分期共同影响预后;四:结论1.敲减PRRC2C显著抑制肝癌细胞增殖、转移能力,促进凋亡能力;2.敲减PRRC2C抑制肝癌细胞的侵袭转移,可能是通过下调N-cadherin、vimentin的表达抑制肝癌细胞EMT实现的;3.PRRC2C表达与HCC患者生存率负相关,与M分期共同影响预后。