胃癌是我国最常见的恶性肿瘤，每年死于胃癌的人数约有16万，其死亡率占全部恶性肿瘤死亡率的1／3，居恶性肿瘤死亡率的第一位，是我国较长时间内恶性肿瘤防治的重点。目前临床上对中晚期胃癌患者的治疗仍无明显突破，手术治疗仍然是其主要手段，约90％死于复发和转移相关的并发症，而肿瘤的微转移是其复发和转移的主要原因。肿瘤的微转移一般是指恶性肿瘤在发展过程中，肿瘤细胞播散并存活于血循环、淋巴道、骨髓及各组织器官中，尚未形成转移结节，无任何临床表现，常规检查方法如影像、病理等难以发现。虽然进入血液循环的癌细胞并不一定都存活，人体内也存在多种因素制约恶性肿瘤的生长，但其自身的生物学特性将决定其发生转移的倾向。血液中瘤细胞的存在是肿瘤血行转移的物质基础，及时发现肿瘤患者血液中的微转移不仅对肿瘤转移和复发的判断有重要意义，而且对指导临床综合治疗亦有重要价值。因此，早期、有效地发现、监测和清除血液中的微量肿瘤细胞是防治肿瘤复发的重要手段。 由于血液循环中肿瘤细胞数量极少，检测其存在非常不易。检测外周血中的微量肿瘤细胞，有两个问题需要解决：一是要有肿瘤特异性的生物标记；二是要有灵敏度高的检测方法。只有很好地解决了这两个问题，才能从大量的血液细胞中检测到极微量的肿瘤细胞。 20世纪80年代初期，Ugelstad等首先使用磁性微粒分离细胞，后由挪威Dynal公司生产免疫磁珠用于分离各种细胞。使用免疫磁珠筛选外周血存在的非造血系统恶性肿瘤细胞的策略有2种：阳性筛选和阴性筛选。前者用被分离物质的抗体包埋免疫磁珠，后者用混合成分中的其它物质的抗体包埋免疫磁珠。在肿瘤研究和临床领域，浙江大学硕士学位论文免疫磁珠显示出广泛的应用一前景，它不仅可以富集肿瘤细胞用于诊断，而且可以除掉血液中的癌细胞，使癌症患者自体输血成为可能。 逆转录一聚合酶链反应(reverse transeript一polymerasee卜a一in reaetion，附一氏附具有敏感性高、特异性强的优点，使检测外周血中的少量癌细胞成为可能。国内外已有一用R丁一尸C尺方法检测癌细胞的报道，其灵敏度达10一弓，明显优于检测淋巴结中肿瘤细胞的方法。 本研究先后采用免疫磁珠阴性筛选和阳性筛选方法富集癌细胞，然后以癌胚抗原(earcinoembryonic antigen，CEA)ml之NA水平，以评价联合应用免疫磁珠和尺T一PC尺值。为标志分子用荧光定量RT一PCR技术检测其技术检测胃癌患者外周血微转移的应用价 材料与方法 入选对象为2002年8月一2003年8月在宁波大学医学院附属医院住院的经病理学检查确诊的胃癌患者，其中男26例，女巧例;年龄48岁一93岁，平均67岁;临床分期为I期7例，11期8例，111期10例，W期16例。良性胃病对照为10例胃溃疡患者，男6例，女4例:年龄50岁一82岁，平均61岁。5例正常对照为健康献血人员。首先将人胃癌MGC一803细胞以不同浓度加入到健康人外周血中，其次用淋巴细胞分离液收集单核细胞，然后等分成4份分别用4种方法处理:直接扩增(A方法)、抗人CD45阴性磁珠筛选(B方法)、抗人Ber一EP4阳性磁珠筛选(C方法)及联用阴性和阳性磁珠筛选(O方法)，最后用实时定量RT一陀R检测pZ微球蛋白(pZmicroglob。lin，p，MG)mRNA和癌胚抗原(CEA)mRNA并计算出相对CEAmRNA值。用上述4种方法分别测定41例胃癌、10例良性胃病患者和5例健康人外周血CEA mRNA。以SPSS10.O软件进行统计学处理:阳性率的比较采用x’检验;CEA mRNA拷贝数以丁士S表示;组间比较采用方差分析;组间两两比较采用q检验。以尸<0.05为差异有显著性意义。 结果 1.参照模型中D方法测出的相对CEA mRNA值(CEA mRNA/p:MG mRNA)均小 于A、B和C方法测出的，其检测灵敏度为每m1血含有1个癌细胞; 2.41例胃癌患者中用A、B、C和D方法测出的阳性例数分别为19例(46.34%)、 23例(56.10%)、22例(53.66%)和27例(65.85%);D方法与A方法比较，浙江大学硕士学位论文 产ko.05:3.41例胃癌患者中用A、B、C和D方法测出的CEA相对表达量分别为1.70士0.22、 1.58士0.24、1.30土0.28和1.13士0.31，D方法与其他方法比较，P<O.OI;4.D方法对不同pTMN分期CEAm尺NA阳性的检测结果，从I期一IV期分别为 28.57%、62.50%、70.00%和81.25%，W期与I期比较，P<O.05;5.D方法检测10例胃溃疡患者CEA mRNA均为阴性，而用A、B和C方法检测 有1例阳性;5例健康人均未见扩增。 结论1.A、B、C和D方法都能检测出外周血中的癌细胞，以D方法最为敏感，其检 测灵敏度为每m1血含1个癌细胞;2.正常人外周血中一般无CEA mRNA的表达;3.早期胃癌可以有CEA mRNA的表达;4.D方法检测出的CEA mRNA的表达与pTMN分期有关;5.联用阴性磁珠、阳性磁珠和实时定量RT一PCR(D方法)可提高CEA mRNA检 测的灵敏度和特异性，提高胃癌患者外周血微转移的检出率。