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研究背景与目的：
胃癌(Gastriccancer，简称GC)的发病率居全球恶性癌症的第四位，死亡率在癌症中排第二。在我国胃癌的发病率和死亡率有持续升高的趋势，目前对胃癌具体发病机制仍有很多尚待明确的地方。临床上许多患者即使接受手术治疗后，仍然会发生肿瘤复发、远处转移，胃癌的转移是导致胃癌患者肿瘤复发和死亡的主要原因。研究胃癌转移的机制一直以来都是当前肿瘤研究领域的重大课题。
微小核糖核酸(MicroRNA，miRNA)是分子生物学研究的热点之一。它是一种小的内源性非编码单链RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成。这些小的miRNA在进化上具有高度的保守性，能够靶向结合mRNA的3’-UTR，来调节mRNAs的表达。miRNAs拥有很多生物学功能，直接或间接干预了生命活动的各个环节，如细胞增殖、细胞的程序死亡、细胞分化、蛋白质代谢、脂肪代谢等。许多研究已经证明miRNA与肿瘤的发生、发展有关，深入研究miRNA的生物学行为，为揭示肿瘤的侵袭转移的机制提供重要契机。
本研究前期在GEO和TCGA数据库中下载胃癌芯片和测序资料，发现miR-4521在胃癌组织中表达下调，并且还未有关于miR-4521的文献报导，所以本课题组选择miR-4521为研究对象，深入探究miR-4521对胃癌侵袭转移的作用，为揭示胃癌侵袭转移的机制提供新的视角。
研究方法：
1.GEO和TCGA数据库中下载胃癌芯片和测序资料，结果显示在胃癌组织中miR-4521表达下调；
2.qRT-PCR、原位杂交检测胃癌组织中miR-4521的表达，并根据病例资料分析miR-4521与胃癌患者性别、年龄、肿瘤浸润深度、分期、转移、预后的关系。
3.构建高侵袭性胃癌细胞系和非侵袭的胃癌细胞系，并在这两种侵袭性不同的细胞中检测miR-4521的表达量。
4.在高侵袭性胃癌细胞中感染携带有miR-4521的重组慢病毒，构建稳定过表达miR-4521的细胞株；同时在非侵袭性胃癌细胞中感染干扰miR-4521表达的重组慢病毒，构建稳定低表达miR-4521的细胞株。
5.在稳定过表达miR-4521细胞株和干扰miR-4521细胞株中，通过Transwell实验、划痕实验检测细胞侵袭迁移能力。
6.用miR-4521过表达的细胞和对照组细胞建立裸鼠腹膜转移模型，观察肠、肠系膜、肝脏转移结节数量和转移结节大小，检验miR-4521对胃癌细胞转移能力的作用。
7.在胃癌细胞中通过荧光定量PCR、WesternBlot检测侵袭转移相关基因表达的改变并找到miR-4521调控的通路。
8.生物信息学网站预测、双荧光素酶报告实验验证miR-4521的靶基因。WesternBlot检测干扰靶基因后相关通路的改变，体外功能实验检测干扰靶基因后胃癌细胞侵袭迁移能力的变化；WesternBlot检测重新表达靶基因后相关通路的改变，体外功能实验检测重新表达靶基因后胃癌细胞侵袭迁移能力的变化。
9.分析miR-4521和靶基因在胃癌组织中的表达相关性。
结果：
1.GEO(芯片数据库)数据库资料显示，在胃癌中低表达的miRNA有268个，TCGA(癌症测序数据库)中，在胃癌中低表达的miRNA有135个。两个数据库结果取交集，发现miR-4521在胃癌组织中表达下调。
2.qRT-PCR、原位杂交均检测出miR-4521在胃癌组织中是低表达的，并且miR-4521表达水平与肿瘤浸润、TNM分期、淋巴结转移、预后均相关。
3.成功筛选出高侵袭性的胃癌细胞：SGC7901inv、BGC823inv，和非侵袭性的胃癌细胞：SGC7901nonv、BGC823nonv。并且miR-4521在高侵袭性胃癌细胞中表达量低，在非侵袭性胃癌细胞中表达量高。
4.成功在高侵袭性胃癌细胞株中稳定过表达miR-4521:SGC7901invLV-4521、BGC823invLV-4521；在低侵袭性胃癌细胞株中稳定干扰miR-4521表达:SGC7901nonvLV-anti-4521、BGC823nonvLV-anti-4521。
5.Transwell小室侵袭实验和划痕实验结果显示，过表达miR-4521能够抑制胃癌细胞侵袭和迁移能力，而干扰miR-4521能够促进胃癌细胞侵袭和迁移能力。
6.裸鼠腹膜转移实验结果显示注射了过表达miR-4521的胃癌细胞的裸鼠，肠、肠系膜、肝结节数量减少。肿瘤体积小，血性腹水形成能力减弱。miR-4521在体内可以抑制胃癌细胞转移。
7.miR-4521在胃癌中过表达可以抑制AKT/GSK-3β/Snail1通路，干扰miR-4521后促进AKT/GSK-3β/Snail1通路活化。阻断AKT/GSK-3β/Snail1通路后，miR-4521对胃癌细胞侵袭迁移能力的作用被阻断。
8.miR-4521可以靶向结合IGF2和FOXM1的3’-UTR，并使IGF2和FOXM1在胃癌中表达下调。
9.在稳定过表达miR-4521的胃癌细胞株中过表达FOXM1的质粒，WesternBlot检测p-AKT、p-GSK-3β、Snail1表达量得到恢复，逆转了miR-4521过表达后对AKT/GSK-3β/Snail1通路的抑制，并且逆转了miR-4521对胃癌细胞侵袭迁移的抑制。在稳定干扰miR-4521表达的胃癌细胞株中干扰FOXM1的表达，p-AKT、p-GSK-3β、Snail1表达下调，逆转了干扰miR-4521后胃癌细胞侵袭能力的改变。
10.在稳定过表达miR-4521的胃癌细胞株中加入IGF2细胞因子，p-AKT、p-GSK-3β、Snail1表达量增加，体外细胞划痕和Transwell小室侵袭实验验证了IGF2可以逆转miR-4521对胃癌细胞侵袭迁移的抑制。收集干扰miR-4521的胃癌细胞的培养基，培养非侵袭性胃癌细胞，结果显示非侵袭性胃癌细胞侵袭能力增强，进一步证实了IGF2可以逆转miR-4521对胃癌细胞侵袭能力的抑制。
11.在胃癌组织中，miR-4521与FOXM1、IGF2、Snail1表达呈负相关。
结论：
miR-4521在胃癌中发挥一个潜在的抑癌基因的作用，它可通过靶向FOXM1、IGF2使AKT/GSK-3β/Snail1通路失活，从而抑制胃癌细胞的侵袭迁移能力。
胃癌(Gastriccancer，简称GC)的发病率居全球恶性癌症的第四位，死亡率在癌症中排第二。在我国胃癌的发病率和死亡率有持续升高的趋势，目前对胃癌具体发病机制仍有很多尚待明确的地方。临床上许多患者即使接受手术治疗后，仍然会发生肿瘤复发、远处转移，胃癌的转移是导致胃癌患者肿瘤复发和死亡的主要原因。研究胃癌转移的机制一直以来都是当前肿瘤研究领域的重大课题。
微小核糖核酸(MicroRNA，miRNA)是分子生物学研究的热点之一。它是一种小的内源性非编码单链RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成。这些小的miRNA在进化上具有高度的保守性，能够靶向结合mRNA的3’-UTR，来调节mRNAs的表达。miRNAs拥有很多生物学功能，直接或间接干预了生命活动的各个环节，如细胞增殖、细胞的程序死亡、细胞分化、蛋白质代谢、脂肪代谢等。许多研究已经证明miRNA与肿瘤的发生、发展有关，深入研究miRNA的生物学行为，为揭示肿瘤的侵袭转移的机制提供重要契机。
本研究前期在GEO和TCGA数据库中下载胃癌芯片和测序资料，发现miR-4521在胃癌组织中表达下调，并且还未有关于miR-4521的文献报导，所以本课题组选择miR-4521为研究对象，深入探究miR-4521对胃癌侵袭转移的作用，为揭示胃癌侵袭转移的机制提供新的视角。
研究方法：
1.GEO和TCGA数据库中下载胃癌芯片和测序资料，结果显示在胃癌组织中miR-4521表达下调；
2.qRT-PCR、原位杂交检测胃癌组织中miR-4521的表达，并根据病例资料分析miR-4521与胃癌患者性别、年龄、肿瘤浸润深度、分期、转移、预后的关系。
3.构建高侵袭性胃癌细胞系和非侵袭的胃癌细胞系，并在这两种侵袭性不同的细胞中检测miR-4521的表达量。
4.在高侵袭性胃癌细胞中感染携带有miR-4521的重组慢病毒，构建稳定过表达miR-4521的细胞株；同时在非侵袭性胃癌细胞中感染干扰miR-4521表达的重组慢病毒，构建稳定低表达miR-4521的细胞株。
5.在稳定过表达miR-4521细胞株和干扰miR-4521细胞株中，通过Transwell实验、划痕实验检测细胞侵袭迁移能力。
6.用miR-4521过表达的细胞和对照组细胞建立裸鼠腹膜转移模型，观察肠、肠系膜、肝脏转移结节数量和转移结节大小，检验miR-4521对胃癌细胞转移能力的作用。
7.在胃癌细胞中通过荧光定量PCR、WesternBlot检测侵袭转移相关基因表达的改变并找到miR-4521调控的通路。
8.生物信息学网站预测、双荧光素酶报告实验验证miR-4521的靶基因。WesternBlot检测干扰靶基因后相关通路的改变，体外功能实验检测干扰靶基因后胃癌细胞侵袭迁移能力的变化；WesternBlot检测重新表达靶基因后相关通路的改变，体外功能实验检测重新表达靶基因后胃癌细胞侵袭迁移能力的变化。
9.分析miR-4521和靶基因在胃癌组织中的表达相关性。
结果：
1.GEO(芯片数据库)数据库资料显示，在胃癌中低表达的miRNA有268个，TCGA(癌症测序数据库)中，在胃癌中低表达的miRNA有135个。两个数据库结果取交集，发现miR-4521在胃癌组织中表达下调。
2.qRT-PCR、原位杂交均检测出miR-4521在胃癌组织中是低表达的，并且miR-4521表达水平与肿瘤浸润、TNM分期、淋巴结转移、预后均相关。
3.成功筛选出高侵袭性的胃癌细胞：SGC7901inv、BGC823inv，和非侵袭性的胃癌细胞：SGC7901nonv、BGC823nonv。并且miR-4521在高侵袭性胃癌细胞中表达量低，在非侵袭性胃癌细胞中表达量高。
4.成功在高侵袭性胃癌细胞株中稳定过表达miR-4521:SGC7901invLV-4521、BGC823invLV-4521；在低侵袭性胃癌细胞株中稳定干扰miR-4521表达:SGC7901nonvLV-anti-4521、BGC823nonvLV-anti-4521。
5.Transwell小室侵袭实验和划痕实验结果显示，过表达miR-4521能够抑制胃癌细胞侵袭和迁移能力，而干扰miR-4521能够促进胃癌细胞侵袭和迁移能力。
6.裸鼠腹膜转移实验结果显示注射了过表达miR-4521的胃癌细胞的裸鼠，肠、肠系膜、肝结节数量减少。肿瘤体积小，血性腹水形成能力减弱。miR-4521在体内可以抑制胃癌细胞转移。
7.miR-4521在胃癌中过表达可以抑制AKT/GSK-3β/Snail1通路，干扰miR-4521后促进AKT/GSK-3β/Snail1通路活化。阻断AKT/GSK-3β/Snail1通路后，miR-4521对胃癌细胞侵袭迁移能力的作用被阻断。
8.miR-4521可以靶向结合IGF2和FOXM1的3’-UTR，并使IGF2和FOXM1在胃癌中表达下调。
9.在稳定过表达miR-4521的胃癌细胞株中过表达FOXM1的质粒，WesternBlot检测p-AKT、p-GSK-3β、Snail1表达量得到恢复，逆转了miR-4521过表达后对AKT/GSK-3β/Snail1通路的抑制，并且逆转了miR-4521对胃癌细胞侵袭迁移的抑制。在稳定干扰miR-4521表达的胃癌细胞株中干扰FOXM1的表达，p-AKT、p-GSK-3β、Snail1表达下调，逆转了干扰miR-4521后胃癌细胞侵袭能力的改变。
10.在稳定过表达miR-4521的胃癌细胞株中加入IGF2细胞因子，p-AKT、p-GSK-3β、Snail1表达量增加，体外细胞划痕和Transwell小室侵袭实验验证了IGF2可以逆转miR-4521对胃癌细胞侵袭迁移的抑制。收集干扰miR-4521的胃癌细胞的培养基，培养非侵袭性胃癌细胞，结果显示非侵袭性胃癌细胞侵袭能力增强，进一步证实了IGF2可以逆转miR-4521对胃癌细胞侵袭能力的抑制。
11.在胃癌组织中，miR-4521与FOXM1、IGF2、Snail1表达呈负相关。
结论：
miR-4521在胃癌中发挥一个潜在的抑癌基因的作用，它可通过靶向FOXM1、IGF2使AKT/GSK-3β/Snail1通路失活，从而抑制胃癌细胞的侵袭迁移能力。