研究背景：最大限度地切除病变、最大程度地保护功能区、提高患者的存活时间及术后生活质量是脑胶质瘤手术治疗的最高目标,但在术前及术中准确地确定肿瘤边界比较困难。研制特异性靶向脑胶质瘤的PET和荧光探针,将PET高探测灵敏度和探针的高特异性相结合在术前将胶质瘤病灶侵犯范围清楚地显示,用荧光将肿瘤“染色”,利用荧光的高探测灵敏度指导手术医生更准确地区分肿瘤与正常组织以便更彻底地切除脑胶质瘤病灶,对提高治疗效果和预后具有重要的意义。脑胶质瘤肿瘤细胞膜上及新生血管内皮细胞膜上存在跨膜蛋白受体(Neuropilin receptor, NRP)明显高表达。tLyP-1是最新发现的NRP受体特异性、高亲和性靶向多肽(其结合能力较对照肽高120倍)。采用荧光和正电子核素18氟(18F)标记tLyP-1有望成为脑胶质瘤特异性靶向分子探针。目的：一、合成NRP受体靶向多肽tLyP-1并验证该多肽与脑胶质瘤细胞的结合能力,为进一步探针制备和胶质瘤靶向显像奠定基础。二、用5-羧基荧光素(5-carboxyfluorescein, FAM)标记tLyP-1多肽制备荧光探针(FAM-tLyP-1),用荧光显像方法研究该荧光探针能否靶向并将胶质瘤“染色”,评价该探针能否发展成为胶质瘤的靶向荧光分子探针。三、用正电子核素18F标记靶向多肽tLyP-1制备PET分子探针(18F-tLyP-1),通过用PET/CT和microPET/CT显像,探索并评价该探针用于胶质瘤PET/CT显像的可行性。方法：一、 NRPl靶向多肽tLyP-1的合成及与胶质瘤细胞的结合试验1.NRP1靶向多肽tLyP-1的化学合成采用固相9-芴甲氧羰基(Fmoc)肽化学合成方法合成tLyP-1。以氯三苯基氯树脂为载体,采用Fmoc氨基保护策略,固相合成tLyP-1(氨基酸序列为：CGNKRTR).第一个氨基酸与树脂的连接采用对称酸酐法,反应结束后用适量的吡啶和乙酸酐封闭树脂上剩余的活性位点。后续氨基酸以HOBt/HBTU/DIEA为缩合剂依次连接。反应结束后,以三氟乙酸为主切割剂将目的肽段从树脂上裂解下来,合成产物经高效液相色谱分离、纯化、分析,质谱分析鉴定。2.FAM-tLyP-1和FAM标记对照肽的合成将5-羧基荧光素(FAM)与多肽tLyP-1(CGNKRTA)的第4位赖氨酸的侧链氨基端相反应,将FAM结合和标记到多肽tLyP-1的第4位氨基酸(赖氨酸)侧链上而制备荧光标记多肽探针FAM-tLyP-1。在采用固相9-芴甲氧羰基(Fmoc)肽化学合成方法合成tLyP-1,当进行第4位氨酸酸残基(赖氨酸)的结合时,选用moc-Lys (Dde)-OH进行连接,当整个多肽序列合成完后,先去掉Fmoc-Lys (Dde)-OH上的(Dde),加入FAM,以HOBt/HBTU/DIEA为缩合剂,通过碳二亚胺活化反应将FAM的羧基与赖氨酸的侧链氨基相连接而将FAM标记到多肽链上。反应结束后,以三氟乙酸为主切割剂将目的肽段从树脂上裂解下来,合成产物经高效液相色谱分离、纯度,质谱分析鉴定。FAM标记对照肽(氨基酸序列为：MAQKTSH)的合成也按FAM-tLyP-1的合成方法进行,FAM也标记在其第4位的赖氨酸残基的侧链氨基基团上。3.体外U87MG细胞与荧光多肽FAM-tLyP-1的结合及抑制试验(1)细胞培养：肿瘤细胞株选用NRP受体表达阳性的鼠脑胶质瘤细胞株U87MG。胶质瘤U87MG肿瘤细胞株在含有高糖并加有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养,隔天更换培养介质。细胞在含有5%二氧化碳温度为4℃的潮湿空气中在组织培养盂内展开,当细胞铺满培养盂后用0.05%胰蛋白酶(EDTA)和0.01M磷酸缓冲液(pH7.4)分离用于进一步细胞培养。(2)结合实验：等细胞数(1×105)的U87MG细胞置于16孔盘中,采用复管方式,每孔分别加入递增浓度(OμM、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、40μM)的FAM-tLyP-1,在4℃的结合缓冲液中孵化1小时使FAM-tLyP-1与细胞充分结合,经用缓冲液清洗3次后用倒置荧光显微镜(inverted fluorescence microscope)进行显像。用白光对细胞形态进行显像,在蓝光激发下对细胞进行荧光显像。(3)竞争抑制试验：等细胞数(1±105)的U87MG细胞置于4个孔内,采用复管方式,分别为A组和B组织,先在每孔内入20μM的未标记tLyP-1液与U87MG细胞在4℃的结合缓冲液中孵化反应30分钟后在A、B组管内分别加入1μM和4μM的同体积FAM-tLyP-1液,然后在37℃的结合缓冲液中再孵化1小时,经用缓冲液清洗3次后用荧光显微镜观察U87MG细胞对荧光标记多肽的摄取强度。4.荷脑胶质瘤U87MG裸鼠肿瘤模型的建立和确认(1)荷脑胶质瘤U87MG裸鼠肿瘤模型的建立：细胞株采用鼠脑胶质瘤U87MG细胞株。取对数生长期的肿瘤细胞,用0.25%的胰酶消化,PBS洗细胞两次；1000r/s离心5min,收集细胞；用0.9%的生理盐水悬浮细胞,定容,以5×106个细胞/0.2ml/只,分别接种于4-6周龄的无胸腺裸鼠的右侧腋窝。SPF条件下饲养,4～6周左右待肿瘤逐渐增长达1.0cm时用于动物实验研究。(2)组织病理学检查为了确认所得到的肿瘤模型符合要求,将荷瘤鼠模型处死,切除肿瘤组织,用福尔马林固定,石腊包埋,将石腊包埋组织置切片机的组织支承架上,做3μm厚的组织切片,置于洁净的载玻片上,37℃干燥过夜,做HE染色。然后用光学显微镜确认肿瘤组织是否为胶质瘤。5.FAM-tLyP-1在肿瘤组织内的摄取及分布研究经荷胶质瘤U87MG细胞株裸鼠的尾静脉注射FAM-tLyP-1(1mM,150μl),1小后处死动物,分离肿瘤组织,先用含有DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole)的染色剂对细胞核进行染色,然后在Olympus DP71荧光显微镜下(Olympus America, Center Valley, PA, USA)用蓝光观察FAM-tLyP-1在肿瘤组织内的分布情况。二、肿瘤模型FAM-tLyP-1荧光显像研究1.FAM-tLyP-1在荷胶质瘤肿瘤模型体内的荧光生物学分布研究经荷胶质瘤U87MG裸鼠肿瘤模型的尾静脉分别注射FAM-tLyP-1或对照肽(1mM,150μ1),1小时后处死动物,分离肿瘤及各脏器、组织后用生理盐水多次冲洗,然后将肿瘤和正常脏器置于干净的玻璃盂上,在Kodak in-Vivo Imaging System F (Kodak, American)下进行荧光显像测量肿瘤及各脏器、组织的荧光摄取量,比较肿瘤与正常组织对FAM-tLyP-1和FAM标记对照肽的摄取差异。2.荷胶质瘤肿瘤模型整体荧光断层显像经荷胶质瘤U87MG裸鼠的尾静脉注射FAM-tLyP-1(1mM,150μl),1小时后处死动物并冷冻,然后用动物切割机进行冠状断层切层,将切层后的肿瘤模型置于干净的玻璃盂上,然后用荧光显像仪进行显像显示肿瘤及各脏器、组织的荧光摄取量。3.荧光显像分析用荧光显像仪Kodak in-Vivo Imaging System F配置的Kodak MI分析软件进行图像分析。在荧光图像上沿肿瘤和各组织的边缘勾画感兴趣区(Region of interest, ROI),测量各感兴趣区内的荧光计数,计算肿瘤与正常组织的肿瘤/非肿瘤比值(tumor/non-tumor,T/NT ratios)。三、PET分子探针18F-tLyP-1的合成和PET/CT显像研究1.合成18F标记辅基18F-SFB以4-(三甲基三氟甲磺酸铵)苯甲酸乙酯为前体,经亲核氟化得4-18F-苯甲酸乙酯,后者经碱水解和酸中和后得4-18F-苯甲酸,4-18F-苯甲酸经氢氧化四丙基铵盐处理和N,N,N,N-四甲基-O-(N-丁二酰亚胺)四氟硼酸脲盐活化反应后生成中间体N-琥珀酰亚胺-4-18F-氟苯甲酸酯(18F-SFB)。18F-SFB采用HPLC进行纯化。2.合成PET分子探针18F-tLyP-1按以下方法合成：18F-SFB10ml分别加入到含有tLyP-1(0.25mg)的40ml硼酸钠缓冲液(50mmol/L, pH8.5)中,反应混合物在40℃下反应30分钟。18F-tLyP-1采用色谱结合固相提取法将其分离,随后用HPLC进行纯化,用0.22-μm微孔滤膜去除细菌。然后用HPLC和放射性薄层层析法(TLC)测定其化学纯度和放化纯度。3.PET/CT和microPET/CT显像：荷胶质瘤U87MG裸鼠经尾静脉注射18F-tLyP-13.70-5.50MBq(100-150μCi),用异氟醚麻醉后于30分钟、60分钟及120分钟行microPET/CT静态显像(采集时间10分钟),观察肿瘤及各部分正常组织对18F-tLyP-1的摄取情况。显像采仪器采用Inveon microPET/CT扫描仪(SIEMENS, Germany)。PET/CT显像：经荷胶质瘤U87MG裸鼠尾静脉注射18F-tLyP-13.70-5.50MBq(100-150μCi),异氟醚麻醉然后在注射显像剂后60分钟PET/CT扫描仪进行静态显像(图像采集10分钟)。所用仪器为Biograph mCTx scanner (SIEMENS, Germany).以上图像均采用3维的有序子集最大期望值法(ordered subsets expectation maximum, OSEM)进行图像重建并用CT进行衰减校正。4. PET/CT和microPET/CT图像分析采用PET/CT和microPET/CT配置的Syngo分析软件,在PET图像上沿肿瘤和各组织的边缘勾画感兴趣区,测量各感兴趣区内的放射性计数,计算肿瘤与正常组织的肿瘤/非肿瘤比值。四、统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行分析。靶向荧光多肽FAM-tLyP-1与FAM标记对照肽的肿瘤／非肿瘤比值比较采用独立样本t检验,18F-tLyP-1microPET/CT显像60分钟和120分钟时相的肿瘤／非肿瘤比值比较采用配对样本t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。结果一、NRP靶向肽tLyP-1的合成和细胞结合试验1. NRP靶向肽tLyP-1的合成固相合成的NRP靶向肽tLyP-1呈现为白色粉末。经质谱分析鉴定,主峰分子量(m/z：Da)为834.9,与tLyP-1的理论分子量833.97相符,证明合成正确。经HPLC纯化、分析结果显示tLyP-1的纯度为99.03%。2. FAM-tLyP-1及FAM标记的对照肽的合成FAM-tLyP-1和FAM标记的对照肽合成后产物均为粉黄色粉末。质谱分析鉴定,FAM-tLyP-1和FAM标记的对照肽的主峰分子量(m/z,Da)分别为1192.8、1213.8,与FAM-tLyP-1和FAM标记的对照肽的理论分子量1192.29、1215.33相符,证明标记成功。经HPLC纯化、分析结果显示两者的纯度分别为98.01%、98.4%。3.FAM-tLyP-1与脑胶质瘤U87MG的体外结合试验体外结合试验结果显示FAM-tLyP-1能为脑胶质瘤细胞所摄取,在FAM-tLyP-1浓度很低(1μM)时,就可见细胞膜及细胞质内出现高强度的绿色荧光,随着FAM-tLyP-1浓度的增加,U87MG荧光摄取强度逐渐轻度增高,而空白对照管无绿色荧光出现,证明FAM-tLyP-1能很好地为U87MG细胞摄取。抑制试验显示U87MG细胞对荧光探针的摄取受超量非标记多肽抑制而明显降低,20倍超量非标记多肽的抑制作用明显强于5倍超量非标记多肽。4.脑胶质瘤U87MG肿瘤模型的建立无胸腺裸鼠皮下接种U87MG细胞,饲养14天左右可见肿瘤结节出现,经4-6周肿瘤增大至1.0cm左右用于实验。共接种6批,每批5只,共30只,其中24只成瘤,6只无肿瘤生长,成瘤率为80%。为了验种肿瘤模型是否符合要求,我们将其中1只模型的肿瘤切下来进行病理组织学检测,病理结果显示符合高级别脑胶质瘤改变。5.荧光多肽在肿瘤组织内摄取及分布研究经荷瘤鼠尾静脉注射FAM-tLyP-1(1mM,150μ1)后1小时和4小时时分离肿瘤组织,制作切片观察荧光标记多肽在肿瘤内的分布情况,结果显示肿瘤组织内荧光大量聚集,在注射后1小时,FAM-tLyP-1大量聚集于肿瘤内新生血管壁上,肿瘤细胞未见明显荧光摄取。在注射后4小时,大部分FAM-tLyP-1仍主要聚集于新生血管壁及其周围,但与新生血管壁邻近的肿瘤细胞内开始可见荧光多肽摄取。此研究显示FAM-tLyP-1在肿瘤组织内主要聚集于新生血管壁,部分为肿瘤细胞摄取。静脉注射FAM-tLyP-11小时后分离荷瘤鼠脑组织行切片荧光显像研究发现正常脑组织内见少量荧光摄取(明显低于肿瘤组织),荧光的分布呈弥漫性性改变,与肿瘤组织内荧光主要聚集于新生血管壁不同。二、胶质瘤FAM-tLyP-1荧光受体显像研究1.FAM-tLyP-1荧光探针在荷瘤鼠体内的生物学分布研究研究结果显示在注射FAM-tLyP-11小时时肿瘤病灶呈现FAM-tLyP-1明显高摄取,而正常脑组织仅见荧光轻微摄取,两者差别非常明显,肿瘤／脑比值为3.44±0.83,除肿瘤／肾、肿瘤/小肠比值低于1.0外,肿瘤与其他脏器的比值均>2.0。从体内分布看,该荧光探针主要通过肝胆系统及泌尿系统排泄,但肝脏清楚较快,在静脉注射后1小时,肝脏内基本未见荧光聚集,大量荧光分布于胆囊、肠道及双肾内。双肺、心脏、肝脏、脾脏及肌肉组织内荧光分布均很低,提示非特异性摄取低。与FAM-tLyP-1不同,静脉注射荧光对照肽1小时后结果显示肿瘤部位荧光摄取较低,仅略高于正常脑组织,其肿瘤／脑比值为1.32±0.15,明显低于FAM-tLyP-1的肿瘤／脑比值(t=-5.547,P=0.001)。2.荷瘤鼠整体荧光断层显像为了更好地整体显示肿瘤及正常组织对FAM-tLyP-1的摄取,经荷瘤鼠尾静脉注射FAM-tLyP-1(1mM,150μ1)1小时后进行荷瘤鼠冠状切层荧光显像,结果显示肿瘤部位荧光大量聚集,而脑组织、心脏、双肺、肝脏及肌肉、骨骼均未见荧光摄取,双肾及小肠荧光分布非常高。整体断层图像显示FAM-tLyP-1能特异性靶向胶质瘤病灶并将其充分“染色”。三、PET分子探针18F-tLyP-1的研制和PET/CT显像研究1)18F-tLyP-1的放化标记参照陈晓元等用18F标记RGD多肽的方法,用18F-SFB做为反应前体,采用酰化反应将18F-SFB与tLyP-1的氨基相结合而成功实现了18F标记。总标记反应时间为140分钟,标记产率为8～12%,经高效液相分离后18F-tLyP-1的放化纯度为98%。2)荷瘤鼠microPET/CT和PET/CT显像研究：microPET/CT显像研究显示在30分钟时肿瘤部位便可见放射性大量聚集,心脏、肝脏、肠道、双肾及膀胱内也见大量放射性分布,血液本底较高。60分钟时肿瘤内放射性大量浓聚,心脏、肝脏及血液本底放射性明显降低,胆囊内出现放射性大量聚集,肠道、双肾及膀胱内也见放射性大量聚集。120分钟时全身血液本底进一步降低,肿瘤显示更清楚。60分钟和120分钟时相肿瘤／脑比值分别为2.98±0.52vs.3.25±0.69(t=-0.956,P=0.393)在注射18F-tLyP-160分钟后,PET/CT显像显示肿瘤部位放射性大量聚集,荷瘤鼠体内放射性分布与microPET/CT一致,但图像质量较microPET/CT差。结论1.本研究成功地合成了NRP受体靶向肽tLyP-1,纯度为99.03%,可满足实验要求。2.成功地用FAM标记tLyP-1而制备了荧光探针FAM-tLyP-1,纯度达98.01%,达到体内及体外实验要求。3.体外细胞摄取实验证明FAM-tLyP-1能被胶质瘤U87MG细胞大量摄取,其摄取符合受体-配体竞争结合规律。4.肿瘤组织荧光显像证明FAM-tLyP-1能大量聚集于肿瘤组织内,FAM-tLyP-1在肿瘤组织内主要分布于新生血管壁,部分为肿瘤细胞摄取。5.荷瘤鼠体内荧光生物学分布研究及整体断层显像显示FAM-tLyP-1能特异性靶向胶质瘤病灶并将病灶充分“染色”,肿瘤／脑比值高,适合用于脑质瘤显像。6.荷瘤鼠体内荧光生物学分布研究显示FAM-tLyP-1主要经肝胆系统及泌尿系统排泄,但肝脏内荧光清除较快。7.成功地用正电子核素18F标记tLyP-1而制备了PET分子探针18F-tLyP-1,放化纯度达98.0%,达到体内及体外实验要求。8.经microPET/CT和PET/CT显像证明18F-tLyP-1可以特异性靶向胶质瘤病灶,在注射后120分钟内随着时间的延长,肿瘤显像更加清楚。荷瘤鼠体内18F-tLyP-1放射性分布与FAM-tLyP-1体内荧光分布相一致。9.荧光显像和microPET/CT显像显示FAM-tLyP-1和18F-tLyP-1可做为靶向胶质瘤NRP受体的荧光和PET分子探针,在胶质瘤的分子显像中具有良好的应用潜能。