本论文主要以质谱为基础的细胞培养的稳定同位素标记技术作为蛋白质组学研究的定量技术平台，详细研究了特异性激动剂引起的巨噬细胞TLR2的天然免疫应答和肿瘤坏死因子刺激下14-3-3 epsilon蛋白复合物的组成变化情况；同时与传统的酶解方法不同，本文也尝试了用微流控芯片技术来固定蛋白酶，实现了复杂的实际样品的快速、高效酶解，并与传统的酶解方法进行了比较。　　 论文的第一章综述了近年来定量蛋白质组学在方法上、技术上及应用方面的研究进展以及蛋白质相互作用技术在生物学上的进展，特别强调了目前应用比较广泛的氨基酸同位素标记的定量蛋白质组学和蛋白质相互作用组学；指出了各种方法的优缺点及应用，并由此引出了本论文的研究背景；文中最后阐述了本论文的研究目的和意义。　　 论文的研究工作主要分三章，第一章涉及的是亚细胞组分的免疫细胞的天然免疫应答；第二章研究的是蛋白复合物的相互作用组；第三章研究的是微流控芯片的实际样品酶解。下面将详细介绍各章内容：　　 (一)蛋白质组学解析特异性激动剂引起的巨噬细胞TLR的天然免疫应答　　 用不同的细菌、病毒或激动剂进行刺激，抗原递呈细胞包括巨噬细胞，能够表达不同的Toll样受体(Toll-like receptor)，通过信号传导途径，产生天然免疫应答，调节下游转录因子活性和特定基因的表达。重要的是，这些炎症信号最终靶向染色质，引起基因表达的改变。为了深入理解特异性激动剂引起的调控机理，在亚细胞组分水平上，我们分析了一个已知的TLR2激动剂-Pam3CSK4所引起的活的巨噬细胞的蛋白质组变化，利用稳定同位素标记的定量蛋白质组学方法鉴定了胞浆部分和染色质相关部分差异表达的蛋白。总共鉴定了1000多个蛋白，其中定量了540个蛋白，大约1/2的蛋白发生了差异表达，并采用WB进行了部分蛋白如FHC、HSP90β、HSP70、14-3-3e、RS6和NF-κBp100等的验证，其结果与质谱鉴定的定量结果一致；同时，对鉴定到的两部分蛋白进行了功能分类和讨论，发现对于S1组分，差异表达的蛋白主要参与了翻译后修饰活动、能量代谢、蛋白转运和细胞死亡等生物学活动；而对于P3鉴定的蛋白，我们借助于生物信息学工具，绘制了鉴定到的核蛋白之间的相互作用网络图，通过对这些蛋白的功能分析，我们发现TLR2激动剂刺激后差异表达的蛋白主要参与蛋白组-泛素化通路、DNA复制和修复、翻译后等生物学过程；最后我们将所得的Pam3CSK4刺激巨噬细胞的蛋白质数据与今年Nature上(Nature，447，(7147)：972，2007)发表的LPS刺激巨噬细胞的微阵列数据进行了比较，发现与前炎症基因相关的一些蛋白其上调趋势是一致的，而与抗微生物基因相关的蛋白其表达变化是不一致的，这进一步说明了不同的TLRs激动剂引起的天然免疫应答的特异性。本章的工作从整体上对TLR激动剂引起的全蛋白的表达变化进行了研究，这一结果将有助于系统了解TLR的信号通路，特别是对与TLR相关的免疫性疾病的诊断、治疗、预防等具有重要的指导意义。　　 (二)TNF-α引起的14-3-3 epsilon蛋白复合物的变化　　 14-3-3蛋白是一种高度保守的酸性可溶性蛋白，现有的研究表明：14-3-3蛋白通过调节细胞内多个信号转导通路而参与多种细胞生命活动的调控，涉及细胞凋亡、生长、增殖、信号转导等，为多功能蛋白。而肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor，TNF)是迄今发现的直接杀伤恶性肿瘤作用最强的生物活性因子，可以通过不同的信号途径导致细胞的生长或凋亡，其中一个很重要的发现就是其可以激发MAP3K信号途径，招募14-3-3蛋白，导致NF-κB信号通路的活化。本章采用氨基酸同位素代谢标记和表位标记的双标记策略，以稳定表达带有标签的14-3-3 epsilon的大量293T细胞为研究对象，采用免疫共沉淀的实验方法，研究了TNF-α刺激下特定的14-3-3ε蛋白的相互作用。表位标记的方法可以提高免疫沉淀效率，增加蛋白复合物鉴定的几率；而以质谱为基础的氨基酸同位素代谢标记的定量方法可以有效去除非特异性结合蛋白。借助这种策略，除了靶蛋白外，我们还鉴定到了包括已知相互作用的蛋白如CDC-37、HSP90、TAK1、TBK1等在内的55个相互作用的蛋白。许多未经报道的蛋白，如DDX21、RuvBL2、PPM1B、核糖体蛋白等被首次报道，并对鉴定到的蛋白进行了WB验证和生物学功能分类分析。我们先选择已知的相互作用蛋白如HSP90、TAK1、TBK1做WB，验证方法的准确性、可行性，其WB结果与实验结果一致；然后我们又选取了未报道的相互作用蛋白如DDX21、RuvBL2、PPM1B，做进一步验证，WB结果也与实验结果一致。与此同时，我们还比较了刺激前后14-3-3ε蛋白复合物的变化情况，发现TNF-α刺激前，鉴定到的蛋白主要参与信号传导、RNA结合、蛋白折叠、氧化还原调节、压力应答、细胞骨架等生物学活动；而TNF-α刺激后，鉴定到有些蛋白参与了TNF信号通路和NF-κB转录调控活化，这一结果说明了TNF-α的特异性刺激。本章的研究结果将对理解细胞内蛋白或信号转导相互作用的网络具有重大意义。同时14-3-3蛋白与多种疾病有关，深入认识14-3-3蛋白可能为治疗一些疾病开辟新思路。　　 (三)微流控反应器在复杂蛋白样品的酶解　　 前面几章研究的蛋白差异表达谱和蛋白相互作用表达谱均采用的是胶上酶解的传统方法，我们还与Dr.Liu研究小组合作，尝试了用微流控芯片反应器作为酶解实际蛋白样品的平台。首先我们用纳米金胶多层膜组装的微流控反应器酶解从小鼠巨噬细胞中提取的水溶性蛋白，将酶解产物用两维液相色谱与Qstar质谱联用的技术进行分离鉴定，并与传统的溶液酶解结果进行比较，发现芯片法和溶液酶解法鉴定到的蛋白分别是194和170个，显然，两者之间的结果是可比的，值得一提的是，芯片法酶解快速，几秒钟即可完成酶解，更具优势。　　 我们还研究了纳米金胶多层膜组装的微流控反应器酶解从巨噬细胞中提取的全蛋白，一次实验即鉴定了497个蛋白，并与胶上酶解鉴定到的蛋白结果进行了比较，发现此种微流控芯片反应器完全可以应用于实际复杂样品的酶解；但是由于不同的提取蛋白试剂或采用不同的质谱鉴定，所得到的结果还是有很大差别。　　 本章实验证明，这种多层纳米金胶组装的微反应器完全可以在线酶解蛋白样品，快速、高效，蛋白样品耗量少，能够用于复杂生物样品的酶解、鉴定。进一步发展该技术，可实现集酶解、分离和鉴定于一体的快速分析复杂蛋白样品的目的，拓宽蛋白质组学研究领域。