【摘 要】
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磷脂酶C（Phospholipase,PLC）能够水解甘油磷脂sn-3位的甘油磷酸酯键,生成甘油二酯和磷酸化合物。目前,PLC的研究较少,主要应用于油脂脱胶工业,不能满足各个行业的需求,造成其在应用上的局限。本研究拓展了其应用领域,为PLC的研究奠定基础。本研究的主要内容及结果如下:本研究从土壤中筛选获得一株产磷脂酶的菌株,经16S r DNA鉴定后,通过构建系统发育树鉴定该菌株为乙酸钙不动杆菌,
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磷脂酶C（Phospholipase,PLC）能够水解甘油磷脂sn-3位的甘油磷酸酯键,生成甘油二酯和磷酸化合物。目前,PLC的研究较少,主要应用于油脂脱胶工业,不能满足各个行业的需求,造成其在应用上的局限。本研究拓展了其应用领域,为PLC的研究奠定基础。本研究的主要内容及结果如下:本研究从土壤中筛选获得一株产磷脂酶的菌株,经16S r DNA鉴定后,通过构建系统发育树鉴定该菌株为乙酸钙不动杆菌,并命名为Acinetobacter calcoaceticus TCCC112146。扩增A.calcoaceticus TCCC 112146的PLC基因（plc）,与载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9k-plc,经测序分析,plc的基因片段长度为2229 bp,编码742个氨基酸。在毕赤酵母中表达重组游离PLC（f PLC）并进行纯化,对f PLC的酶学性质进行分析发现:以p-NPPC为底物其最适反应条件为50℃、p H 9.0,在50℃以下、p H8.0-10.0范围内具有良好的稳定性;f PLC的Kcat/Km为178.26 1/m M/s;通过f PLC对不同结构磷脂的底物特异性研究,发现其更倾向于水解头部为磷酸乙醇胺的磷脂;将plc基因与毕赤酵母表面展示载体pKFS连接,构建重组质粒pKFS-plc,并将其转化至毕赤酵母感受态GS115中,构建细胞表面展示PLC毕赤酵母重组菌株GS115/pKFS-plc,得到重组表面展示PLC（d PLC）,对d PLC全细胞催化剂的酶学性质进行分析发现:d PLC的最适温度为50℃、最适p H值为9.0;d PLC在60℃以下,p H 8.0-10.0范围内稳定,稳定性得到提升。对dPLC催化鞘磷脂合成神经酰胺的条件进行优化,最适催化条件为:底物添加量5.0 mg/m L、d PLC酶添加量为3000 U、反应温度40℃、p H 8.0、反应时间4 h,神经酰胺产率到达51%;d PLC重复利用7个批次后,神经酰胺的相对产率仍可达到初始反应批次的51%。
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