MicroRNA-155(miR-155)由位于人21号染色体和小鼠16号染色体上的B细胞融合群集(BIC)基因的非蛋白编码的转录本加工处理而来。miR-155，跟其他microRNAs(miRNAs)一样，经由RNA聚合酶Ⅱ转录，产生初级转录物（pri-miR-155）。pri-miR-155在细胞核中进行处理，以产生miRNA的前体(pre-miR-155)。随后，pre-miR-155被转运到细胞质中，并进一步由Dicer酶加工生成23个核苷酸长的双链miRNA。基于5末端的稳定性，该miRNA双链体的一条链(passenger miR-155)被释放和降解，而另一条链（引导链或成熟miR-155）被保留，并加载到RNA诱导的沉默复合物(RlSC)来结合靶mRNA，通过抑制蛋白质翻译或诱导mRNA降解来调节基因表达。Pre-miR-155的两个臂可以分别根据5或3链的选择而发育成为成熟的miR-155-5p或miR-155-3p。然而，据报道，miR-155-5p的表达水平比miR-155-3p高20-200倍。　　虽然miR-155最初被描述为一种致癌性的miRNA，缺乏BIC的miR-155敲除小鼠证实miR-155在先天免疫和适应性免疫中有着关键作用。据报道miR-155缺失的树突状细胞抗原递呈效率降低。同时，miR-155能调节自然杀伤细胞中IFN-γ的产量，控制CD4+T辅助细胞亚群向Th1、Th2以及Th17细胞分化，以及促进调节性T细胞(Treg)的发育。在CD8+细胞中，miR-155对于T效应细胞功能的发育和记忆性细胞毒性淋巴细胞(CTL)的形成非常重要。此外，miR-155对于B细胞产生同种型转换的、高亲和力的抗体而言是必不可少的。　　在免疫应答过程中miR-155的表达量动态变化，miR-155过表达与血液系统恶性肿瘤、癌症、病毒感染和自身免疫性疾病等多种疾病相关。目前miR-155的检测方法主要是基于定量逆转录聚合酶链反应（定量RT-PCR）、基因芯片和深度测序。这些方法只代表了miR-155在RNA水平上的表达，不能反映miR-155在活细胞里的实时活性与功能。最近，Schug及他的同事报道，单单RNA表达水平的评估并不能反映miRNA的活性，miRNA的活性能被多种因素影响，比如RNA结合蛋白的影响、mRNA与靶标miRNAs的比率，侧翼序列的同源性以及miRNA亚细胞定位的改变，这些都提示miRNA功能在体内有着独特的调节。有研究组通过将miRNA靶序列插入报告基因（如LacZ、绿色荧光蛋白和荧光素酶）的3-UTR中的方法建立miRNA感受器，从而在活体系统中研究miRNA活性。虽然这些感受器可以在体内检查miRNA的活性，但其在单个细胞中是否有效还不清楚。目前进行miR-155检测的方法主要是根据定量逆转录聚合酶链反应（定量RT-PCR），基因芯片和深度测序。这些方法代表了在RNA水平的miR-155的表达，不反映的miR-155活动的实时功能的活细胞。　　目的:本研究旨在建立一个miR-155-5p感受器转基因小鼠，用于在单个活细胞中检测或跟踪miR-155-5p活性。　　方法和结果:首先，将与miR-155-5p完全互补的23碱基序列的4串联拷贝插入到萤火虫荧光素酶基因的3-UTR中，确定miR-155-5p的靶标对象。miR-155-5p的靶标首先在HEK293T细胞的常规荧光素酶报告基因得到检测证实，该HEK293T转染了一个携带miR-155-5p靶标的pmirGLO和表达miR-155或者miR-146a（作为miRNA对照）的载体。结果表明，与转染了miR-146a的HEK293T细胞相比，miR-155-5p靶标与整个miR-155-5p相互作用，导致荧光素酶信号降低（图6A）。随后，我们通过将4×miR-155-5p靶序列插入到DTR.BFP融合报告基因（称为DTR.BFP-155T）的3-UTR构建了miR-155-5p感受器。流式细胞仪分析发现miR-155-5p能中断BFP报告信号，导致剂量依赖性试验中BFP表达水平降低（图6B）。接着，为了构建能进行组织特异性检测与切除的miR-155-5p感受器转基因小鼠，我们将1463 bp的DTR.BFP-155T片段插入到LoxP-STOP-LoxP元件的下游，以阻止该报告基因的转录。再将LoxP-STOP-LoxP-DTR.BFP-155T整个片段插入到广泛表达的R26位点的转录起始位点下游（图8A）。然后，将被修饰的BAC构建体显微注射到B6×DBA2F1小鼠受精卵的原核中，构建R26-DTR-155T感受器的转基因小鼠。携带一个除miR-155-5p靶序列之外相同的基因的R26-DTR小鼠作为对照。我们得到founder47和founder84，一个用来获得R26-DTR-155T小鼠和一个用来获得R26-DTR小鼠。　　为了鉴定转基因阳性的小鼠，将三个转基因阳性的小鼠分别与CMV-Cre转基因小鼠杂交在一起，由于CMV的启动予在所有的细胞中都可以启动，因此可以在所有活的细胞中将Ioxp中间的终止元件切掉。在miR-155-5p高表达的细胞中，miR-155-5p可以结合在miRNA的3UTR来降解mRNA从而抑制蛋白的翻译;在miR-155-5p低表达的细胞中就不存在这种作用。我们可以通过流式检测DTR或者BFP报告基因的表达水平指示内源miR-155-5p的表达水平(图8B)。在三只转基因小鼠中都可以检测到BFP和DTR的表达，由于DTR的信号更好，所以我们在此研究中选择DTR作为报告基因。　　其中两只转基因小鼠和对照相比，在Tconv CD4和Treg中DTR的表达较低，47号转基因小鼠DTR表达比84号要低，这可能表明，不同拷贝数的转基因插入或不同的整合位点导致miR-155-5p目标报告mRNA不等量表达。重要的是，在R26-DTR-155T转基因小鼠中，调节性T细胞与Tconv细胞相比DTR表达下调，但在对照R26-DTR小鼠中没有看到这种现象（图9）。　　接下来，为了进一步验证细胞内DTR的水平降低是由于miR-155-5p的活性造成的，我们运用miR-155的阻断剂antagomiR-155（anti-miR-155）阻断细胞内miR-155-5p的活性。流式结果显示一旦miR-155-5p的活性被阻断之后DTR的表达水平显著增高。之一结果表明内源性miR-155-5p的活性会显著影响DTR的表达水平。　　最后，我们用CMV-Cre× R26-DTR-155T和R26-DTR对照小鼠来检测静息状态下miR-155-5p在conv CD4(CD4+Foxp3-)、Treg(CD4+Foxp3+)、CD8和B细胞内的活性。和我们之前的结果相一致，在静息状态下只有Treg细胞表达DTR。　　之前有文章报道，相对于初始Treg细胞和初始常规CD4细胞而言miR-155在效应性T细胞和记忆性T细胞内表达水平较高。我们运用CD44和CD62L来检测miR-155-5p在效应性T细胞内的活性。我们发现相较于R26-DTR小鼠而言，在R26-DTR-155T小鼠体内中CD44high或者CD62Llow活化的常规CD4和Treg细胞中低表达DTR。另外，在活化的常规CD4和Treg细胞（CD44high或者CD62Llow）明显不同于未活化细胞（CD44low或者CD62Lhigh）。这一结果证明了R26-DTR-155T小鼠对不同miR-155-5p活性的反应能力，相较于初始T细胞而言，在效应性T细胞中miR-155-5p表达水平更高。　　因为miR-155-5p在Treg细胞中高表达，因此本研究将R26-DTR-155T转基因小鼠(founder47和founder84)分别与Foxp3-GFP-Cre× R26-YFP转基因小鼠杂交获得三阳性转基因小鼠（Foxp3-GFP-Cre× R26-YFP×R26-DTR-155T mice）。流式分析结果表明，根据DTR表达量的不同可以将Treg细胞分为两群:DTR阳性的(miR-155-5plow)Treg细胞及DTR阴性的(miR-155-5phigh) Treg细胞（图12A）。DTR-Treg细胞很可能为exFoxp3细胞，即这些Treg细胞之前表达过Foxp3，之后Foxp3的表达丢失。为了验证此假设，本课题用1％多聚甲醛预固定Treg细胞以防止YFP荧光丢失，然后再用Foxp3染色试剂盒对这些细胞进行Foxp3染色。这种染色方法可以区分Foxp3+ Treg细胞(YFP+Foxp3+)以及exFoxp3 Treg细胞(YFP+Foxp3-)。结果表明exFoxp3细胞仍然高表达miR-155-5p（图11B）。此结果与预期的并不一致，因为之前有研究发现Treg细胞中Foxp3的表达对于维持miR-155-5p的表达是必不可少的。以上结果暗示其他的信号通路如TCR信号也可能诱导miR-155-5p的表达。根据CD62L和CD44的表达量不同，Treg细胞可以分为中心性Treg细胞(cTR)和效应性Treg细胞(eTRade)。与conventional T细胞相似，CD62LIow CD44high的效应性Treg细胞高表达miR-155-5p。(图11B和11D)　　为了分析DTR+Treg细胞是否可以被DT消除，本课题对转基因小鼠注射DT，然后监测外周血细胞中Treg细胞的数量变化。结果表明Foxp3-GFP-Cre× R26-YFP转基因小鼠在注射DT后Treg细胞的比列没有明显变化，而Foxp3-GFP-Cre× R26-YFP×R26-DTR转基因小鼠由于没有miR-155-5p的靶序列，在注射DT后其90％的Treg细胞都会被消除，对带有miR-155-5p靶序列的转基因小鼠分析表明，founder47和founder84在注射DT后分别有55％和25％的treg细胞会被消除，此结果与之前流式分析这两个founder小鼠DTR+Treg细胞在Treg细胞中比例的结果是相一致（图13）。以上结果表明可以将R26-DTR-155T小鼠中miR-155-5p表达量不同的细胞通过DT清除来加以区分。　　总结:在活体动物里研究miRNA功能是miRNA生物学领域中一个新的挑战。在本研究中，我们通过把一个广泛表达、含DTR和BFP的报告子插入到miR-155-5p靶序列的下游，成功构建了一种新型的miR-155-5p转基因小鼠品系。为了保证效率和灵敏度，我们选择BAC转基因的办法来构建miR-155-5p转基因小鼠品系——R26-DTR-155T。本研究中，我们使用了一个先前已经证实的鼠BAC克隆RP24-85L1来构建R26-DTR和R26-DTR-155T BAC转基因品系。Giel-Moloney等人已经证明包含R26位点的187 kb BAC能控制转基因广泛而统一地表达。此外，BAC转基因的多个拷贝在原核显微注射后可以整合到小鼠染色体上，这可以显著增加转基因的表达水平。我们发现，CMV-Cre× R26-DTR小鼠DTR的表达量与R26 knock-in品系的表达量的确是一样的。但是，R26-DTR-155T小鼠DTR表达量与大多数细胞类型中miR-155-5p表达量呈负相关。此外，降低的DTR表达量可以通过抑制内源性miR-155-5p活性来部分恢复。因此，这种新的miR-155-5p转基因小鼠品系可以用于在体内跟踪感兴趣的特定细胞类型中的miR-155-5p活性。　　我们认为，R26-DTR-155T老鼠被证明是体内研究不同miR-155-5p表达量的细胞亚群的有效模型。此外，我们还预期，这些小鼠可以作为在多种不同的实验背景里跟踪活化细胞中miR-155-5p活性的有用工具。