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在后基因组时代,蛋白质结构和功能的研究常需要大量的活性蛋白。大肠杆菌仍然是目前最常用的外源蛋白表达系统。但外源蛋白在大肠杆菌中大多表达为不可溶的包涵体蛋白,从而限制了蛋白质科学研究。因此,从包涵体中获取有活性的目的蛋白是目前蛋白质制备中最为关键的技术瓶颈之一。为此,本研究主要开展了三个方面的工作：(1)尝试开发一台变性蛋白复性装置,用于执行当前最广泛使用的复性方法或过程,并满足常规的蛋白质纯化操作；(2)探究包涵体二步变性和复性技术可提高可溶蛋白得率的机制；(3)基于包涵体两步变性和复性技术,针对特定蛋白开发从包涵体中获取活性蛋白的技术方案。本研究首先尝试将当前最广泛使用的复性方法---稀释复性、透析复性和柱复性等,集成在一台自动化的装置中。该变性蛋白自动化复性装置包括四元梯度阀、数控泵、复性釜、超滤膜组件、电磁阀、色谱柱、检测器、控制系统等配件。原理上,该装置不仅能够独立执行上述三种复性方法,还可以组合两种或两种以上的复性技术以拓展复性过程,还能够完成蛋白复性后溶液的在线浓缩、纯化等工作。本论文选择了不同的变性蛋白复性方法用来评估该装置的效果：稀释与透析复性方法联合用于人干细胞趋化因子1(human stromal cell-derived factor1, SDF/CXCL12)和硫氧还蛋白-人artemin融合蛋白(thioredoxin-human artemin fusion protein, Trx-ARTN),稀释复性方法用于硫氧还蛋白-人类胰岛素生长因子Ⅰ融合蛋白(thioredoxin-human insulin-like growth factor1fusion protein, Trx-IGF1)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP),柱复性方法用于牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)。特别是,复性后SDF/CXCL12、Trx-ARTN、Trx-IGF1等蛋白溶液直接进行在线富集和分离纯化。本研究还利用缓慢降低变性剂浓度的策略对上述五种蛋白的复性过程进行了初步的优化。例如,反向稀释和透析方法能够从30mg蛋白纯度为～60%的变性蛋白中获得10.5mg蛋白纯度为～92%的SDF/CXCL12,其目的蛋白产率是稀释和透析复性方法的2倍；在BSA复性实验结果中,连续透析复性方法的正确折叠蛋白产率是～95%,而柱复性方法的是～50%。本研究结果说明,调节溶液流速、混合比例和流路选择就可以设定和维持整个变性蛋白复性过程。而且,在该变性蛋白复性装置上联合使用缓慢降低变性剂浓度的策略和蛋白后续操作是一种很好的进行大规模蛋白制备的方法。本课题组之前开发了一种简单、高效的包涵体处理工艺,即包涵体二步变性和复性技术(Two-step denaturing and refolding techniques,2DR)。包涵体蛋白首先溶解在7M盐酸胍溶液中,随后梯度稀释盐酸胍浓度至大量蛋白沉淀析出；蛋白沉淀再次溶解在8M尿素溶液中进行后续复性工艺。2DR的可溶蛋白得率和活性蛋白收率明显优于常规的一步变性和复性方法(One-step denaturing and refolding techniques,1DR)。鉴于此,本研究还进一步探索了2DR技术优势的缘由及相应的蛋白变性和复性技术方案。首先,与常规的包涵体洗涤过程相比,2DR的包涵体洗涤工艺在包涵体蛋白纯度、活菌存活数量、包涵体颗粒完整性等方面不存在明显的差异。然后,以EGFP包涵体蛋白为模型,蛋白质折叠／去折叠平衡实验揭示2DR和1DR之间的差异来自8M urea溶解的对象。激光共聚焦拉曼光谱实验说明2DR中的蛋白沉淀与包涵体蛋白在蛋白质二级结构组成、含芳香环氨基酸暴露程度、半胱氨酸暴露程度等方面具有相似性,但其他谱带如680～800cm-1、1020～1100cm-1、1120～1220cm-1、1380～1420cm-1等反映出C-C、 C-N、 C=O等化学键的结构和环境存在很大的差异性。于是,这些在物质和结构组成上的差异就有可能增强了后续的变性蛋白的复性效率。然后,本研究借鉴分子伴侣蛋白GroEL/GroES帮助蛋白质折叠的机制,探索各种物理化学溶液条件对折叠中间体的第二次变性或构象约束。EGFP折叠中间体先经过0.5M L-Arg和300mM NaCl等条件的构象约束作用,除去添加物分子后继续在自发状态下折叠,蛋白的再折叠效率达到80%。最后,以日本血吸虫MTH1蛋白复性为例,在二步变性和复性技术基础上,通过复性液的筛选及复性过程的优化,从0.5升LB培养基获得单体形式的MTH1蛋白15mg且纯度大于95%。至此,本研究提出以折叠中间体的第二次变性或构象约束为策略来设计包涵体蛋白变性和复性的技术方案。综上,本研究首次将当前最广泛的复性方法集成在一台装置以提高变性蛋白复性工作效率,并在包涵体二次变性复性技术基础上,探索和发展了包涵体蛋白变性和复性工艺,为提高蛋白质制备工作效率奠定了良好的技术基础。