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抑郁症（depression）是一种以心境低落、认知功能损害、思维迟缓和意志力减退等临床症状为特征的情感障碍性精神疾病,其困扰着世界上约12.8%的人口。世界卫生组织预测到2020年,抑郁症将跃居至仅次于冠心病的全球第二位疾病。值得关注的是,大量研究资料显示,女性患有抑郁症的概率是男性的两倍以上,并且具有病程更长、复发率更高的特点。尤其是处于更年期阶段的女性的抑郁症患病率明显高于生命过程中的其他年龄阶段,而围绝经期相较于绝经后期有更高的患病率。目前,更年期抑郁症具体的发病机制尚不明确,也缺乏客观诊断指标及有效的治疗方法。常采用的激素替代等治疗方法对重度更年期抑郁症疗效不佳、副作用多,因此,深入研究更年期抑郁症的发病机制、寻找新的治疗靶标和治疗方法迫在眉睫。“一次性摘除双侧卵巢结合慢性温和不可预见性应激”是目前常用的更年期抑郁症的造模方式,该模型不能很好的模拟围绝经至绝经期时激素水平逐渐下降的变化过程,存在一定的局限性。因此,本文工作中,我们尝试采取“分次摘除卵巢结合慢性温和不可预见性应激”的造模方法制备更年期抑郁症小鼠模型,并与传统的抑郁症模型进行比较,评价其作为一种新的更年期抑郁症模型的可行性。小分子非编码RNA（micro RNA,miRNA）是一类由内源基因编码、长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,参与基因表达的转录后调控过程。miRNA在神经系统中广泛存在,参与调控神经递质合成和释放、神经环路形成和情绪调节等过程,也参与了包括抑郁症在内的多种神经精神疾病的发病进程。对更年期抑郁症小鼠血液miRNA表达谱分析后发现包括mi R-99a在内的一系列表达发生明显改变的miRNA,并且mi R-99a的靶基因为FK506结合蛋白FK506-binding proteins,FKBP51),FKBP51参与了对突触可塑性等功能的调控过程,因此mi R-99a可能介导了更年期抑郁症的发生与发展过程。因此本文将初步探索更年期抑郁症的病理机制。本文工作的第一部分首先采取分次摘除双侧卵巢结合慢性温和不可预见性应激的方式构建新的更年期抑郁症动物模型,并从行为学、神经递质、激素水平等方面评价新模型相较于传统模型的优越性,是否更贴近更年期抑郁症临床表现,是否可以作为更年期抑郁症研究的模型基础。第二部分以mi R-99a为研究对象,通过基因芯片分析更年期抑郁症小鼠miRNA的表达变化,并验证脑内mi R-99a的表达情况,研究其下游FKBP51的表达及对下丘脑内突触可塑性及功能的影响,探索mi R-99a与更年期抑郁症的相关性,为更年期抑郁症的治疗提供了新的思路。第一部分一种新的更年期抑郁症模型的建立与评价目的:采用分次摘除卵巢结合慢性温和不可预见性应激的方法构建新的更年期抑郁症动物模型,比较该模型与经典更年期抑郁症模型的差异,评价该模型可行性,确认其是否更适合用于更年期抑郁症研究的病理模型。方法:将雌性C57BL/6J小鼠随机分为五组:假手术组（Sham）、慢性温和不可预见性应激组（chronic mild stress,CMS）、一次性摘除双侧卵巢（bilateral ovariectomy,BO）结合CMS组（CMS+BO）、摘除单侧卵巢（unilateral ovariectomy,UO）结合CMS组（CMS+UO）、分次摘除双侧卵巢结合CMS组（CMS+UO+UO）,持续造模3个月,并在1个月、2个月、3个月时分别处死动物收集样本,进行如下研究实验:（1）通过糖水偏爱实验（sucrose preference test,SPT）、悬尾实验（tail suspension test,TST）、强迫游泳实验（forced swimming test,FST）等行为学实验评价各组小鼠抑郁状态;（2）应用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定血清中皮质酮（corticosterone,CORT）、雌激素（estradiol,E2）、脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）的浓度;（3）应用实时荧光定量PCR法（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测下丘脑中炎症相关分子,如白介素-1β（interleukin-1beta,IL-1β）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNFα）、白介素6（interleukin 6,IL-6）,同时检测了海马中5-HT受体表达水平;（4）应用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）检测海马内去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）、多巴胺（dopamine,DA）、3,4-二羟基苯乙酸（dihydroxy-phenyl acetic acid,DOPAC）、高香草酸（homovanillic acid,HVA）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）、五羟吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA）、谷氨酸（glutamic acid,Glu）、天冬氨酸（aspartic acid,Asp）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）、牛磺酸（taurine,Tau）、甘氨酸（glycine,Gly）、丝氨酸（serine,Ser）和谷氨酰胺（glutamine,Gln）的含量;（5）应用Western blot的方法观察海马内雌激素受体β（estrogen receptorβ,ERβ）的表达;（6）应用小动物活体micro-CT影像系统观察小鼠胫骨端部的骨形态,评价更年期小鼠的骨质疏松状态。结果:（1）行为学数据表明,相较于Sham组小鼠,各CMS应激组小鼠的糖水偏爱率和体重改变显著降低、FST和TST中小鼠不动时间显著增加,表明CMS造模引起小鼠抑郁样状态;（2）与Sham组相比,更年期抑郁症小鼠下丘脑中炎症相关因子IL-1β、IL-6和TNFα表达显著增加;血清中CORT表达水平显著增加,HPA轴出现紊乱现象。相较于CMS+BO组,CMS+UO+UO组炎症因子的测定中表现出更为稳定的增加;（3）CMS+UO和CMS+UO+UO组小鼠海马内单胺类和氨基酸类神经递质出现显著性的紊乱。更年期抑郁症也引起了CMS+UO+UO组小鼠脑内5-HT2CR、5-HT2AR受体表达显著增加,5-HT转运体（SERT）表达显著减少,与更年期抑郁症的临床现象表现有更高的相似性。（4）摘除卵巢之后,相较于其他组,CMS+BO组和CMS+UO+UO组血清中的E2含量显著下降,并且CMS+UO+UO组中ERβ的表达呈现出更为稳定的下降趋势。在应激和卵巢摘除的共同作用下,BDNF含量显著下降,在CMS+UO+UO组中表现最为明显。（5）CMS+UO与CMS+UO+UO组相较CMS+BO组出现了更为严重的骨质量下降、骨小梁数目与厚度的减少和骨小梁断裂等现象,出现向骨质疏松发展的趋势。（6）摘除卵巢后,造模一个月时更年期抑郁症组子宫呈病理性水肿状态,造模第二个月、第三个月时子宫质量显著下降,呈萎缩状态。结论:分次摘除卵巢结合慢性不可预见性应激的造模方法能够成功模拟更年期抑郁症的病理过程和病理特征,相较于传统的造模方式具有更稳定且更贴合更年期抑郁症临床表现的优势,是更适用于更年期抑郁症研究的病理模型。第二部分更年期抑郁症病理机制的初步探索目的:应用建立的更年期抑郁症小鼠模型,初步探索更年期抑郁症的病理机制;在应用芯片筛选、发现mi R-99a与更年期抑郁症相关的基础上,进一步研究、揭示其在更年期抑郁症中的作用,为阐明更年期抑郁症新的病理机制提供实验依据。方法:（1）应用ELISA的方法分析小鼠血液中多种激素和因子的表达,包括孕激素（progestin）、醛固酮（aldosterone）、甲状腺激素（T3）、胰岛素（insulin）、S-100蛋白、促炎因IL-1β和TNF-α、转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）的含量;（2）应用miRNA芯片分析更年期抑郁症模型组小鼠和对照组小鼠下丘脑miRNA表达谱,筛选出差异表达基因,并进行聚类分析。应用q RT-PCR检测小鼠下丘脑、海马、前额叶皮层、纹状体四个脑区中mi R-99a的表达情况;（3）应用Western blot的方法分析下丘脑内FKBP51、核内外孕激素受体（progesterone receptor,PR）、突触后致密物（postsynaptic density protein 95,PSD-95）和突触素（synaptophysin,SYN）的表达;（4）采用免疫荧光方法观察下丘脑室旁核（paraventricular nucleus,PVN）中FKBP51、PSD-95的表达情况;（5）应用透射电镜的方法观察下丘脑内突触的形态改变;（6）采用电生理的方法记录小鼠脑片长时程增强（long-term potentiation,LTP）,分析突触功能改变情况。结果:（1）ELISA结果表明,更年期抑郁症模型组小鼠中孕激素、胰岛素和S-100含量显著减少,醛固酮、IL-1β和TNF-α含量显著增加,更年期抑郁症中内分泌和神经功能处于紊乱状态;（2）基因芯片筛选出一系列表达发生变化的miRNA,其中mi R-99a的表达显著下降,q RT-PCR分析确认更年期抑郁症小鼠下丘脑、海马、纹状体、前额叶皮层中的mi R-99a的表达降低,尤其在下丘脑中mi R-99a表达下降最为明显;（3）通过western blot和免疫荧光实验发现,mi R-99a表达降低会引起其靶基因FKBP51表达的增加,并减少了下丘脑内PR从核外进入核内的过程;（4）western blot和免疫荧光结果显示,突触相关蛋白PSD-95和SYN表达减少。电镜观察结果显示,下丘脑内突触膜结构遭到破坏,突触后致密物厚度减少,突触密度降低;电生理LTP记录结果显示,更年期抑郁症模型组小鼠LTP现象受到抑制,场兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potential,f EPSP）斜率显著低于对照组。结论:更年期抑郁症小鼠体内出现了内分泌、免疫和神经功能紊乱状态,下丘脑中mi R-99a表达下降,可能通过负性调控FKBP51的表达从而影响脑内突触可塑性,进而导致更年期抑郁症的脑功能障碍发生。综上所述,本文工作的主要创新之处:1.建立并评价了一种新的更年期抑郁症模型的造模方法,为将其作为更年期抑郁症研究的病理模型提供了实验依据;2.揭示了mi R-99a与更年期抑郁症的相关性,为阐明更年期抑郁症新的病理机制提供了实验依据。