丙戊酸钠(valproic acid,VPA)是临床上治疗癫痫的常用药物。2001年Gottlicher发现VPA是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(inhibitor of histone deacetylases,HDACi),通过调控组蛋白的乙酰化影响基因转录。越来越多的证据表明HDACi能够促进多种细胞的成骨分化,包括骨髓间充质干细胞,脂肪来源干细胞等。因此,作为HDACi,使用VPA能促进成骨细胞成熟以及骨愈合,并且使用浓度为临床使用剂量,安全性可靠。激素性股骨头坏死(osteonecrosis of femoral head,ONFH)是临床上长期困扰骨科医生的难题,发病机制涉及激素抑制干细胞成骨分化,因此VPA可能通过改善干细胞成骨达到预防股骨头坏死的目的。目的:体外观察激素及激素联合应用丙戊酸钠对骨髓间充质干细胞、人微血管内皮细胞生物学的影响,体内观察丙戊酸钠对大鼠激素性股骨头坏死模型的预防作用。方法:(1)人骨髓间充质干细胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells,hBMSCs)的获取、培养和鉴定:Picoll分离液联合全骨髓法进行干细胞提取,培养;成骨、成脂分化以及流式细胞仪检测细胞表面标志物进行hBMSCs的鉴定。(2)VPA对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells,hBMSCs)增殖以及凋亡的影响:CCK-8法测定各浓度VPA作用下hBMSCs的增殖效果,Annexin V-FITC/PI双染法检测hBMSCs的凋亡率。(3)VPA对hBMSCs成骨分化的影响:VPA(0.5~2mM)加入成骨培养基,hBMSCs在相应条件下成骨培养后,检测ALP活性、成骨相关蛋白Runx2、ALP及相关基因Runx2、ALP、OCN、Col I的表达,茜素红染色观察骨矿化结果。(4)VPA联合地塞米松(dexmethasone,DEX)对hBMSCs成骨分化的影响:VPA(0.5~2mM)加入含有DEX(10~-55 M)成骨培养基中,hBMSCs在相应条件下成骨培养后,检测ALP活性、成骨相关蛋白Runx2、ALP、Col I及相关基因Runx2、ALP、OCN、Col I的表达,茜素红染色观察骨矿化结果。(5)VPA对hBMSCs迁移的影响:获取正常人以及ONFH患者的hBMSCs,VPA(0.5~2mM)作用两种hBMSCs两日后,检测SDF-1α、CXCR4蛋白及基因表达,Transwell小室检测细胞迁移能力。(6)VPA联合DEX对人微血管内皮细胞成血管(HMEC-1)的影响:VPA(0.5~2mM)加入含DEX的培养基中作用于HMEC-1两日后,检测成血管相关基因的表达以及成血管能力。(7)建立大鼠激素性ONFH模型:使用甲基强的松龙(methylprednisolone,MP)20mg/kg连续3周,每周连续3日,每日一次大鼠臀大肌注射,6周后通过micro-CT、微血管灌注以及HE染色检测股骨头坏死是否发生。(8)VPA对大鼠ONFH的预防性治疗:造模期间予以300mg/kg VPA腹腔注射,每日1次,连续3周,6周后通过micro-CT、微血管灌注以及HE染色检测股骨头坏死是否发生。结果:(1)hBMSCs能稳定增殖,并向成骨和成脂分化;流式细胞仪检测表面标志物结果:CD29(95±3.7%),CD44(91±2.1%),CD73(98±1.4%),CD90(98±2.3%),CD105(76±6.2%)均为阳性。(2)低浓度VPA(0.5~2mM)不影响hBMSCs增殖,高浓度(5mM)抑制增殖,但均不影响hBMSCs凋亡。(3)VPA能够促进hBMSCs成骨相关基因和蛋白的表达,促进ALP活性以及钙盐沉积。(4)VPA能改善DEX对hBMSCs成骨的抑制作用,上调成骨相关基因和蛋白的表达,改善DEX作用下hBMSCs ALP活性以及钙盐沉积。(5)激素性ONFH患者hBMSCs本身存在CXCR4和SDF-1α表达降低,迁移能力下降,VPA作用后能显著提高其CXCR4,SDF-1α蛋白表达水平,改善其迁移能力。(6)VPA能改善在DEX作用下HMEC-1成血管基因的表达,促进血管形成。(7)大鼠激素性股骨头坏死模成功建立,表现为:骨小梁变细断裂,骺板退变,骨髓坏死。(8)VPA降低股骨头坏死的发生率。结论:VPA能促进激素作用下hBMSCs的成骨分化、迁移,促进HMEC-1血管形成,预防大鼠股骨头坏死。