论文部分内容阅读
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是引起食源性疾病的一种重要致病菌。食用污染该菌的海产品如蟹、牡蛎、虾、贝等会引起食物中毒。中国国家食源性疾病监控网络数据显示,近年来沿海地区副溶血弧菌中毒的发生规模和人群暴露规模呈明显上升趋势,并且超过沙门氏菌跃居首位,因此,建立快速、灵敏的副溶血弧菌检测方法对于食品安全监控具有重要意义。目前,PCR检测方法以其灵敏、特异、快速的特点,已广泛应用于副溶血弧菌的检测,该方法最关键的环节在于特异性检测靶点的选择及其引物的设计,其优劣将影响到副溶血弧菌检测效率和特异性。目前文献报道的副溶血弧菌检测靶点数量有限,主要局限于gyrB、toxR、tdh、th等早期报道的基因中,其特异性和灵敏度已不能满足当今快速、灵敏的检测要求,因此,发掘新的分子检测靶点十分必要。随着生物信息学和分子生物学技术的发展,大量的细菌基因组被测序并发布,这为从副溶血弧菌基因组中通过序列比对的方法发掘新的分子检测靶点提供了重要的资源。本论文主要从以下三个方面进行了比较系统的研究:1、构建本地BLAST比对分析体系。基于Windows操作平台,建立了本地细菌核酸数据库,该数据库包含了139株代表菌株的基因组序列。同时建立了本地BLAST分析比对系统,用于本地BLAST比对分析。2、利用自动发掘副溶血弧菌特异性序列片段的方法。采用C++编写可执行程序,建立了一种大规模发掘副溶血弧菌特异性序列片段的方法。通过利用副溶血弧菌CDS自动切割程序、BLAST比对连续调用程序以及结果自动分析筛选程序,分别从副溶血弧菌两条染色体的3080和1752个CDS中发掘出20个特异性序列片段。NCBI已有的记录表明,目前对此20段序列片段尚未有任何相关功能分析的报道。3、引物设计与常规PCR实验验证。本文从筛选得到的特异性序列片段中选择了4段,用来设计PCR扩增引物,并对所设计的4对引物进行了相关的实验验证与评价。研究结果表明,借助生物信息学技术筛选得到的副溶血弧菌特异基因序列作为分子检测靶点,对该菌纯模板DNA和纯培养物的检测灵敏度分别可达到13.6 fg/μL和2.17×104 cfu/mL,同现有的副溶血弧菌检测靶点相比,具有较高的特异性和灵敏度。